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第1篇

【關鍵詞】骨髓內皮細胞GMCSF細胞增殖

EffectsofGranulocyteMacrophageColonyStimulatingFactoronGrowthofMurineBoneMarrowEndothelialCells

AbstractThepurposeofthisstudywastoinvestigatetheeffectsofgranulocytemacrophagecolonystimulatingfactor(GMCSF)onthegrowthofmousebonemarrowendothelialcells.Endothelialcellculturemedium（EndoM）wasusedtoculturemurinebonemarrowendothelialcells.EndothelialcellcolonieswerecountedundermicroscopebyWrightGiemsastaining.TheeffectofdifferentconcentriationofGMCSFontheproliferationofbonemarrowendothelialcellswasobservedbytheformationofendothelialcellcolonies,MTTandflowcytometry.TheresultsindicatedthattheendothelialspecificmarkervWFwasexpressedbythecolonycells,GMCSFpromotedtheproliferationofbonemarrowendothelialcellcoloniesandMTTconfirmedtheeffectofGMCSFonpromotingtheproliferationofbonemarrowendothelialcells.TheresultofdetectingcellcycleshowedthattherateofcellsenteringintoSphasewas9.3%inGMCSFaddedgroupandtherateofcellsenteringintoSphasewas2.1%incontrol.Therewasnosignificantdifferenceincellgrowthcurvebetweenthefirstpassageandfourthpassage.ItisconcludedthatGMCSFcanpromotetheproliferationofbonemarrowendothelialcells,theproliferationpotentialofbonemarrowendothelialcellsbetweenthefirstandfourthpassagenosignificantlychanges.

Keywordsbonemarrowendothelialcells;GMCSF;proliferation

JExpHematol2007;15(3):622-625

目前，已有許多報道證明內皮細胞（endothelialcells,EC）、內皮祖細胞（endothelialprogenitorcells,EPC）可以用來治療缺血性心臟病以及各種疾病引起的肢體缺血［1,2］也可以用于組織工程的血管構建［3］，并取得了一定的成果。Kawamoto等［4］報道，EPC對缺血心臟病進行治療具有良好的效果，一方面減少了缺血組織的面積，同時改善了心臟的功能。Kalka等［5］則報道了利用EPC對肢體缺血的小鼠模型進行治療，實驗結果表明了EPC能顯著增加缺血肢體的灌流，而且組織學檢查發現缺血部位毛細血管的數目也大大增加。內皮細胞的來源有多種，可以從外周血、臍血及骨髓中獲得［6］，而外周血中的內皮祖細胞來源于骨髓。從病人自體的骨髓中獲得內皮細胞，一方面來源比較方便，而且也可以避免GVHD的發生。但是由于骨髓基質細胞種類多，難以分離純化骨髓內皮細胞或內皮祖細胞。本研究用本實驗室配制的內皮細胞培養液（EndoM）體外培養小鼠骨髓細胞，分離純化骨髓內皮細胞及內皮祖細胞，并觀察粒巨噬系集落刺激因子（rmGMCSF）對小鼠骨髓內皮細胞體外增殖的影響以及體外增殖后內皮細胞增殖機能的改變，這對臨床運用內皮細胞或內皮祖細胞治療疾病有一定的指導意義。

動物

昆明小鼠，由中南大學湘雅醫學院動物學部提供，雌雄不限，普通飲食。

主要試劑和儀器

IMDM為Gibco公司產品；新生牛血清購自杭州四季清生物制品研究所；重組小鼠粒巨噬細胞集落刺激因子（rmGMCSF）為R&D公司產品；vWF抗體、CY3標記的羊抗兔IgG為Sigma公司產品；MTT、二甲基亞砜（DMSO）為Sigma公司產品；酶標儀為Awarens公司產品；CO2培養箱購自美國Forma。

小鼠骨髓內皮細胞及內皮細胞集落的培養

用頸椎脫臼法處死小鼠，在無菌條件下取出股骨，用IMDM沖出骨髓細胞，制成單細胞懸液，取1×106個小鼠骨髓單個核細胞種入1ml含有15%新生牛血清的EndoM培養體系，置于24孔板中，于37℃、5%CO2、飽和濕度下培養5天后,用胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，按每孔1×104個細胞種入24孔板，每組3孔。于二氧化碳培養箱內培養15天后計數內皮細胞集落數，以≥50個細胞的聚合計為1個集落。

內皮細胞的形態觀察及vWF的檢測

培養的骨髓內皮細胞集落經WrightGiemsa染色后，顯微鏡下觀察內皮細胞形態。用間接免疫熒光法檢測骨髓內皮細胞vWF。將內皮細胞培養于24孔板內放置的蓋玻片上，當細胞間沒有明顯的間隙時，取出蓋玻片，用PBS清洗，用4%的多聚甲醛固定30分鐘，用PBS洗3次：2%的正常羊血清封閉4小時，加入vWF抗體，4℃過夜，用PBS洗3次，加入二抗CY3IgG，37℃孵育60分鐘,PBS洗3次：置于熒光顯微鏡下觀察。以本室建的小鼠骨髓內皮細胞株［7］為陽性對照，骨髓成纖維細胞為陰性對照。

不同濃度的GMCSF對小鼠骨髓內皮細胞形成集落的影響

取純化的小鼠骨髓內皮細胞培養于24孔板中，每孔5000個細胞，在基本培養體系（含1%濃度EndoM）的基礎上分別加入5、10、25ng/ml的rmGMCSF，對照組不加入GMCSF，每組3孔。置于CO2培養箱培養15天，于倒置顯微鏡下記數集落數，≥50個細胞的聚合計為1個內皮細胞集落。

GMCSF對內皮細胞增殖影響的MTT法測定

將純化的小鼠骨髓內皮細胞按5000個/孔培養于96孔板，每孔0.2ml，每組3孔。實驗組培養體系中分別加入5、25、100ng/ml的rmGMCSF，對照組內不加。在37℃、5%CO2、飽和濕度下分別培養5天和10天，取出培養板吸去培養液，然后加入無血清的IMDM180μl和20μlMTT溶液，放入培養箱孵育4小時，吸去液體，各孔加入DMSO150μl，振蕩10分鐘，使結晶充分溶解。選擇492nm波長，在酶標儀上測定各孔的光吸收值（OD492）。

生長曲線

純化的小鼠骨髓內皮細胞培養于96孔板中，每孔5000個細胞，加0.2ml含15%新生牛血清的基本培養液，并加入25ng/ml的rmGMCSF。共種6組，每組3孔，培養5天后，分別于第7、9、11、13、15天用胰酶消化后計數細胞，每次3孔，求平均值，做出生長曲線。按公式DT=t×1g2/(1gN-1gN0)算出第1代內皮細胞生長的倍增時間。

細胞周期的流式細胞術檢測

無菌條件下取小鼠骨髓單個核細胞，按2×106個細胞種于6孔培養板中（2ml培養體系中含15%新生牛血清的EndoM），置于37℃、5%CO2、飽和濕度下培養5天，然后吸去培養液，加入兩種不同培養體系，對照組加含15%新生牛血清的IMDM，實驗組加15%新生牛血清的IMDM和100ng/ml的rmGMCSF，每組各10孔，置于CO2培養箱培養3天后，用胰酶消化細胞，200×g,離心5分鐘，用PBS洗滌細胞2次之后，用300μlPBS重懸細胞，加入冰冷的乙醇（-20℃）約700μl（終濃度為70%），將細胞放于-20℃過夜處理后，用流式細胞儀檢測細胞周期。

細胞傳代培養

取小鼠骨髓單個核細胞，按2×106個細胞種于6孔培養板中（2ml體系中含15%新生牛血清的EndoM），置于37℃、5%CO2、飽和濕度下培養5天，然后吸去培養液，加入15%新生牛血清的IMDM培養液和100ng/ml的rmGMCSF，促使細胞融合，再按1∶4傳代于6孔板中，同樣加入15%新生牛血清的IMDM和100ng/ml的rmGMCSF，等細胞生長至融合，按1∶4傳代，加入相同培養體系。按上述方法傳4代后，繪制生長曲線，方法同前。公式DT=t×1g2/(1gN-1gN0)算出第4代內皮細胞生長的倍增時間，并與第1代的倍增時間進行比較。

統計學處理

實驗數據為3次結果，以mean±SD表示。不同處理組兩組間比較采用t檢驗，應用SPSS軟件分析，P<0.05表示有統計學意義。

結果

細胞形態每孔種入小鼠骨髓內皮細胞5000個，對照組加基礎培養液,實驗組在基礎培養液的基礎上分別加入rmGMCSF5、10、25ng/ml。與對照組相比，實驗組集落數均明顯增多（圖3），說明rmGMCSF對小鼠骨髓內皮細胞的增殖有明顯刺激作用。

rmGMCSF對內皮細胞增殖的影響

小鼠骨髓內皮細胞培養5、10天，分別進行MTT的檢測，結果表明rmGMCSF對小鼠骨髓內皮細胞生長促進作用明顯，各組與對照組相比差異顯著（P<0.01）（圖4）。

GMCSF對EC細胞周期的影響

運用流式細胞儀檢測細胞周期，觀察GMCSF對EC細胞周期的影響。結果顯示GMCSF使細胞進入S期的比例為9.3%，與對照組2.1%相比有明顯差別。此結果說明GMCSF能夠促使細胞進入S期，加快細胞的分裂，從而促進了細胞的增殖（圖5）。Figure5.EffectofGMCSFoncellcycleofendothelialcells.A:grouptreatedbyGMCSF.B:controlgroup.

體外擴增傳代對內皮細胞增殖的影響

圖6為小鼠骨髓第1代和第4代內皮細胞的生長曲線。利用計算公式［DT=t×1g2/(1gN-1gN0)］計算出第1、4代細胞生長的倍增時間分別為30.25±0.55小時、31.67±0.26小時。第1代與第4代的細胞倍增時間相比，無明顯差異，表明經體外擴增傳代4次，仍能保持傳代早期的增殖潛能。

Figure6.Growthcurveofthefirstandfourthpassagegenerationsofmurineboneendothelialcells.討論

國內外對于骨髓內皮細胞的純化報道較少，但已經進行了一些關于細胞因子對內皮細胞增殖影響的研究，如Yonekura等［8］報道VEGF可以促進內皮細胞的增殖，Rieck等［9］則報道bFGF可促進角膜內皮細胞的生長。我們此前曾報道了VEGF、bFGF、SCF、IL6、GMCSF等對內皮細胞株的增殖有促進作用［10］。GMCSF對未經轉化的骨髓內皮細胞增殖的作用尚未見報道。本研究中，我們用本室配制的培養基在較短的時間內純化了小鼠的骨髓內皮細胞，vWF為陽性，并在此基礎上觀察了GMCSF對骨髓內皮細胞增殖的影響。應用基本培養基培養內皮細胞集落時，形成的集落數較少，加入rmGMCSF后，集落生成明顯增多。MTT的結果亦支持GMCSF對小鼠骨髓內皮細胞生長的刺激作用。細胞生長曲線的結果表明，在含GMCSF培養的條件下，內皮細胞生長的倍增時間為30.25±0.55小時，經4次傳代后細胞倍增時間無明顯延長，表明體外培養擴增4代后，細胞仍能保持早期的增殖能力，GMCSF對骨髓內皮細胞的體外增殖有明顯刺激作用。文獻報道內皮細胞表面有GMCSFR的存在，而內皮細胞本身也可以分泌GMCSF［11］。結合細胞周期測定的結果，可以認為，GMCSF促內皮細胞增殖的機制可能是GMCSF與GMCSFR結合，通過細胞內信號傳遞使更多的細胞進入S期來實現的。

【參考文獻】

1LuttunA,CarmelietG,CarmelietP.Vascularprogenitors:frombiologytotreatment.TrendsCardiovascMed,2002;12:88-96

2RafiiS,LydenD.Therapeuticstemandprogenitorcelltransplantationfororganvascularizationandregeneration.NatMed,2003;9:702-712

3ZammarettiP,ZaischAH.Adult‘endothelialprogenitorcells’.Renewingvasculature.IntJBiochemCellBiol,2005;37:493-503

4KalkaC,MasudaH,TakahashiT,etal.Transplantationofexvivoexpandedendothelialprogenitorcellsfortherapeuticneovascularization.ProcNatlAcadSciUSA,2000;97:3422-3427

5KawamotoA,TkebuchavaT,YamaguchiJ,etal.Intramyocardialtransplantationofautologousendothelialprogenitorcellsfortherapeuticneovascularizationofmyocardialischemia.Circulation,2003;107:461-468

6HristovM,ErlW,WeberPC.EndothelialProgenitorCells:isolationandcharacterization.TrendsCardiovascMed,2003;13:201-206

7王綺如，嚴燕，汪保和.小鼠骨髓內皮細胞系的建立.中國實驗血液學雜志，1997；5：360-366

8YonekuraH,SakuraiS,LiuX,etal.PlacentagrowthfactorandvascularendothelialgrowthfactorBandCexpressioninmicrovascularendothelialcellsandpericyts.Implicationinautocrineandparacrineregulationofangiogenesis.JBiolChem,1999;274:35172-35178

9RieckP,OliverL,EngelmannK,etal.Theroleofexogenous/endogenousbasicfibroblastgrowthfactor(FGF2)andtransforminggrowthfactorsbeta(TGFbeta1)onhumancornealendothelialcellsproliferationinvitro.ExpCellRes,1995;220:36-46

第2篇

經過全面、細致的一輪復習后，學生已基本掌握了教材知識，作為二輪復習的重點則應切實加強對新課程標準和2012年考試說明的研究，以此制定復習目標，這樣復習才有針對性和實效性。如：2012年考試說明中對細胞增殖內容的要求。

從近幾年的高考來看，命題重點圍繞細胞周期中染色體行為和數目變化規律，減數分裂與有絲分裂的比較及圖像識別，減數分裂的過程及與遺傳的關系。那么學生在這塊內容中到底還有哪些未落實到位？又該如何幫助學生有效解決這些問題？

一、典型錯誤分析

【典例】圖為雄果蠅體內某細胞分裂過程中，每條染色體上DNA含量變化(甲曲線)和染色體數目變化(乙曲線)。請據圖回答：

(1) CD段細胞中有( )條染色體，DE段有染色單體( )條，FG段細胞中有DNA( )個，DE段可形成四分體( )個。

(2)在A點若用3H標記該細胞的DNA雙鏈，再將其轉入不含3H的培養基中

培養，在FG段一個細胞中的染色體總數和被3H標記的染色體數分別為( ) ( )。

(3)若該細胞基因型為AaXbY，在分裂完成后產生了一個AYY的，則另三個的基因型分別為( )( )( )。

(4)該細胞某一條染色體的兩條單體相同位點出現不同基因的變化可發生在( )段。

該題考查目標：有絲分裂與減數分裂的曲線辨析，減數分裂中染色體、DNA、單體的數目變化規律，染色體、DNA、脫氧核苷酸鏈之間的關系，及減數分裂與生物變異的聯系。通過學案反映出學生存在以下幾方面的問題：

1.基礎知識不扎實，記憶不牢，知識點混淆。例如：在第(1)小題中學生由于把果蠅染色體數4對記成了4條從而造成CD段錯寫為含4條染色體。由于不明確四分體的概

(3)糾錯補偏，反思內化。有一句教育的真理“世界上最有價值的習題不是專家出的習題，而是自己做錯的習題”。二輪復習抓錯題相當機的導航燈一樣，它可以幫我們指明前進的方向。學生在一輪復習中已做了大量試題，經歷了多次模擬考試，難免出現許多錯誤，若能指導學生將這些錯誤進行分類整理，就會發現反復出錯的地方就是自己知識上的薄弱環節，這時就可針對性地翻閱書本，結合書本來解決知識漏洞，當然有些錯誤可能是學生不注意使用生物科學術語回答，畫圖表、寫實驗設計不規范嚴謹等造成的，通過糾錯也可有效提醒學生對自己這方面問題的關注。

二輪復習不做題不行，但沉迷于題海也不行，關鍵要提高做題質量。總結歸納常見題型的解題規律、方法技巧，從而達到弄懂一道題，旁通一類題的目的。也可通過演練近幾年的高考真題親身感觸高考題的命題思路、設問方式，從中感悟解題技巧。

3.消除情感夢魘，增強自信。 美國著名心理學家Robert Rosenthal曾做過這樣一個實驗：他從某個班級的花名冊中隨意挑選了幾個名字，并且告訴老師這些學生經過測試智商較高。之后，老師便關注并鼓勵他們，這些學生也由于有了自信而努力學習。八個月之后，那些“高智商”的學生的成績竟有了驚人的進步。這個實驗證實了自信的重要性。那么如何增強學生對考試的自信，以實現從容應考呢？

(1)充分的考前準備：多數學生都有這樣的體會：“一看到考題不難，緊張不安的情緒便會隨之減少，腦子不再麻木，思維也變得靈活了。”因此，考前一定要做好知識與技能雙重準備，并針對考試中可能出現的復雜情況，進行有目的的訓練，做到胸有成竹，考試當然也充滿信心。

(2)適當的心理調節：既要正確對待壓力，但也不能給自己增加壓力。不過多去想考試成敗將會給自己帶來什么后果，尤其不夸大考試成敗的影響，樹立“天生我材必有用”的廣闊意境。

第3篇

原創試題：藥物Q可抑制HE細胞增殖，但因有較大毒副作用而使其應用受到限制。為確定另一種能抑制細胞增殖的新藥Tet的抑制效果，研究者提出了以下實驗思路。

（1）分組。

甲組：培養液+HE細胞+生理鹽水

乙組：培養液+HE細胞+ X

丙組：培養液+HE細胞+適宜濃度Tet試劑

每組設置若干個重復樣品。

（2）每組樣品放置在Y環境中，恒溫培養一段時間。

（3）測定每組樣品OD值（反應活細胞數量），并統計分析。

（要求與說明：答題時用Q、Tet、OD表示相關名詞，不考慮加入藥物后的體積變化等誤差）

請分析回答：

（1）實驗中選擇的HE細胞應具 能力。

（2）實驗思路中使用的X試劑和Y儀器分別是 、 。

（3）預測實驗結果及結論： 。

一、 基于試題素材的分析

1.素材來源

試題背景材料出自《中華實驗外科雜志》“粉防己堿對皮膚瘢痕組織細胞增殖和凋亡的影響”。[1]

2.素材選擇原因及策略

首先，符合試題命制的真實性原則。試題以科學研究的現實問題為載體，避免學習內容機械化和抽象化，有利于公平、客觀地考查學生的知識水平，能有效提高試題的信度、效度和區分度。同時，也體現了生物學知識與技術、社會的聯系，滲透STS教育理念。

其次，符合試題命制的新穎性原則。試題情境新穎，緊扣學科前沿，特別是試題中運用的陽性對照這一重要且新穎的思維方法，這有利于培養學生的知識遷移能力和分析、解決實際問題能力，側重能力考查。

再次，符合生物學新課程倡導的探究性原則。實驗是考查學生探究能力的最好平臺，是培養學生創新能力的良好途徑。結合該試題可以使學生體驗科學研究的一般過程，強化科學探究的意識，促進學生學習方式的轉變。

二、基于學生答題反饋的分析

（1）分裂或增殖（此處部分學生回答“分化”，主要原因是分裂和分化的概念辨析錯誤）。

（2）適宜濃度的藥物Q（此處部分學生回答“不添加試劑”，主要原因是不清楚藥物Q在實驗中起陽性對照作用）、CO2培養箱（此處主要有兩種錯誤回答，第一種是回答“恒溫培養箱或光照培養箱”，主要原因是混淆植物組織培養和動物細胞培養的差異；第二種是回答卡氏瓶，主要原因是不熟悉動物細胞培養的基本過程，不能靈活應用所學生物學知識）。

（3）由于該實驗為探究性實驗，所以結果有三種可能性：①若三組OD值，甲>丙>乙，則藥物Tet有抑制作用，但抑制效果不如藥物Q；②若三組OD值，甲>丙=乙，則藥物Tet和藥物Q的抑制效果相似；③若三組OD值，甲>乙>丙，則藥物Tet抑制效果優于藥物Q（此處主要有兩種錯誤回答，第一種是只考慮了其中一種結果，主要原因是將本試題理解成驗證性實驗，未考慮到實驗結果具不確定性。第二種錯誤回答是同時考慮了藥物Tet有無毒副作用和有無抑制效果或抑制效果強弱兩個角度，所以出現了6種甚至9種可能結果，主要原因是審題不清，其實題目中已明確該實驗目的只是確定能抑制細胞增殖的新藥Tet的抑制效果強弱，而無需考慮該藥物的毒副作用）。

三、基于試題設計的分析及策略

首先，利用科研論文為試題命制的素材需規避復雜的實驗原理和步驟。科研論文是科研成果的體現，而科學研究是一項原理復雜、技術含量高、周期長的工作。本試題素材論文的研究目的是，探討粉防己堿（Tet）對皮膚創面愈合瘢痕組織細胞增殖周期和凋亡相關基因bcl-2 表達的影響，研究步驟包括建立動物模型及分組、染色觀察細胞增殖、檢測細胞周期和凋亡蛋白表達率等。背景材料和復雜的實驗方法并不是我們的測量目標，對此相關內容在命制試題時應采取規避處理。同時，減少被試者對背景材料的熟知程度，也有利于減少系統誤差。[2]但命題者在對材料處理過程中，始終要確保試題科學性，科學性是創新試題的首要標準，否則創意再好的錯誤命題都是失敗的。

其次，試題的語言表述應簡潔規范，不存在無效信息。命制原創試題的一個重要策略是試題信息簡約化，要有利于被試者進行趨同思維而不產生歧義。這樣，一方面可以減少試題閱讀量，另一方面使被試者獲得清晰的解決問題的信息，才能突顯能力考查。[2]為此筆者在命制該試題時，參考了2011年浙江省理科綜合高考實驗與探究試題的文字表述，但從被試者答題反饋中可以看到，本試題在表述上仍存在不足之處，試題中“有較大毒副作用而使其應用受到限制”就屬于無效信息，在一定程度上干擾了被試者的思維方向，這種無效信息可以刪除。

再次，在問題設計上應體現知識和能力并舉的指導思想。試題考查了實驗材料性質、對照方法、動物細胞培養方法和實驗結果預測等四個方面。其中實驗材料性質和對照組的設計主要考查被試者獲取和分析試題信息的能力；動物細胞培養需CO2培養箱考查了被試者利用教材知識解決實際問題的能力；實驗結果預測考查了被試者的發散思維和創新能力。在考查學生所學生物學知識的基礎上，也側重對被試者的能力考查。

此外，試題問題設計還應體現層次梯度，遵循從易到難原則，貼近被試者的思維習慣，有利于保證試題的信度和效度。

科研論文極大地豐富了試題命制的素材來源，但創作一道好題，還需命題者具有較強的專業知識和命制技巧，以及對教材的深刻理解和對學生思維習慣的準確把握。科研論文為創作實驗與探究紙筆測試題提供了廣泛資源和全新視角，以此為素材的命題思路值得繼續研究與探索。

第4篇

論文關鍵詞：EM原露在信鴿飼養中的應用

 

“EM”是“有益微生物群”的英文縮寫，是日本琉球大學比嘉照夫教授等研究出來的新型復合微生物菌劑，它由光和細菌、乳酸菌、酵母菌等10個屬、80多種微生物復合培養而成。國內已有很多廠家生產此類產品。微生物不僅含有較高的優良蛋白質、氨基酸，還有豐富的維生素以及大量的類胡蘿卜素、抗病毒物質、生長促進因子和提高群體免疫能力的活性物質，作為添加劑加入飼料中飼喂能促進生長，提高抗病能力。用EM液養禽有提高飼料轉化率、促進禽類生長、防治消化道疾病、使飼料脫毒、改善環境衛生、提高繁殖率和幼雛成活率等作用。

一、EM原露的主要成分

1、光合菌群（好氣性和嫌氣性）。如光合細菌和藍藻類。具有光合作用和固氮作用。屬于獨立營養微生物 ，能自我增殖。菌體本身含60%以上的蛋白質 ，且富含多種維生素，還含有輔酶Q10、抗病毒物質和促生長因子；它以土壤接受的光和熱為能源，將土壤中的硫氫和碳氫化合物中的氫分離出來，變有害物質為無害物質，并以植物根部的分泌物、土壤中的有機物、有害氣體（硫化氫等）及二氧化碳、氮等為基質，合成糖類、氨基酸類、維生素類、氮素化合物、抗病毒物質和生理活性物質等，是肥沃土壤和促進動植物生長的重要力量。

光合菌群的代謝物質可以被植物直接吸收，還可以成為其它微生物繁殖的養分。光合細菌如果增殖，其它的有益微生物也會增殖。例如：VA菌根菌以光合菌分泌的氨基酸為食餌 ，它既能溶解不溶性磷，又能與固氮菌共生，使其固氮能力成倍提高。

2、乳酸菌群（嫌氣性）。以嗜酸乳桿菌為主導。它靠攝取光合細菌、酵母菌產生的糖類形成乳酸。乳酸具有很強的殺菌能力，能有效抑制有害微生物的活動和有機物的急劇腐敗分解。乳酸菌能夠分解在常態下不易分解的木質素和纖維素，并消除未分解有機物產生的種種弊端;合成各種氨基酸，維生素、產生消化酶、促進新陳代謝生物論文，還有融化不溶性無機磷的能力。

乳酸菌還能夠抑制連作障礙產生的致病菌增殖。致病菌活躍，有害線蟲會急劇增加，植物就會衰弱，乳酸菌抑制了致病菌，有害線蟲便會逐漸消失論文的格式。

3、酵母菌群（好氣性）。它利用植物根部產生的分泌物、光合菌合成的氨基酸、糖類及其它有機物質產生發酵力，合成促進根系生長及細胞分裂的活性化物質。酵母菌在EM原露中對于促進其它有效微生物（如乳酸菌、放線菌）增殖所需要的基質（食物）提供重要的給養保障。此外，酵母菌產生的單細胞蛋白是動物不可缺少的養分。

4、革蘭氏陽性放線菌群（好氣性）。它從光合細菌中獲取氨基酸、氮素等作為基質，產生出各種抗生物質、維生素及酶，可以直接抑制病原菌。它提前獲取有害霉菌和細菌增殖所需要的基質，從而抑制它們的增殖，并創造出其它有益微生物增殖的生存環境。放線菌和光合細菌混合后的凈菌作用比放線菌單兵作戰的殺傷力要大得多。它對難分解的物質，如木質素、纖維素、甲殼素等具有降解作用，并容易被動植物吸收，增強動植物對各種病害的抵抗力和免疫力。放線菌也會促進固氮菌和VA菌根菌增殖。

5、發酵系的絲狀菌群（嫌氣性）。以發酵酒精時使用的曲霉菌屬為主體，它能和其他微生物共存，尤其對土壤中酯的生成有良好效果。因為酒精生成力強，能防止蛆和其他害蟲的發生，并可以消除惡臭。

二、EM原露在信鴿所以中作用

EM原露具有改良土壤、增強光合作用、改善水質、除臭糞、促生長、抗病、改善信鴿品質、抑菌等功效。用EM原露飼養信鴿，有幾大好處：

1、提高成活率

⑴使有益菌群迅速在腸道內占據優勢，調節腸道內微生態平衡。

⑵對腸道無任何刺激，保護腸道內黏膜。

⑶有效預防雛雞白痢、大腸桿菌等疾病的發生。

⑷保肝護腎，調節機體內分泌，提高免疫力。

⑷有效促進信鴿生長發育。

通過飼喂EM原露，可大大提高信鴿成活率，提高5~10%。

2、提高免疫力

用EM原露長期飼喂信鴿，可以有效的刺激胸腺、脾臟和法氏囊的發育，提高信鴿的免疫功能，同時能明顯增強淋巴細胞的活性，明顯增強機體的細胞免疫和體液免疫，從而大大降低疾病防治費用，提高信鴿和肉鴿飼養的綜合效益。

3、提高飼料轉化率

用EM原露制料長期飼喂，克激活與蛋白質和碳水化合物代謝有關的酶，從而提高它們的效率。使鴿飼料的消化率明顯的提高，有助于消化過程。同時能提高鴿子對鈣、磷等多種微量元素的吸收利用率。

4、有效減少發病率

用EM原露制作料飼喂信鴿，可以有效的阻止沙門氏菌、大腸桿菌、霉菌、球蟲等致病微生物和寄生蟲的生長和繁殖，促進有益菌的生長，長期維護腸道微生物菌群的平衡，有效減少發病機率。

5、促進生長，提高品質

通過飼喂EM原露制作料，可明顯的促進鴿子的生長發育，提高平均重量，可大幅的提高信鴿的品質。

6、改善飼養環境

用EM原露制作料飼喂信鴿，還可以改善鴿舍環境的功能，使鴿舍內二氧化碳、氨氣等有害氣體顯著減少生物論文，減少量為85%以上。鴿糞臭味明顯下降。

綜上所述，通過飼喂EM原露制作料，可以大幅提高鴿子成活率，降低信鴿養殖綜合成本 20%左右。

三、EM原露在信鴿飼養中的具體應用

EM原露用于信鴿最簡單的使用辦法，就是按一定比例兌水后直接給鴿子飲用。具體作法是：用1份（毫升）EM原露，1份（克）紅糖，加水至一定比例即可。其中紅糖是作為一種營養物質，它能保持EM原露中菌群的活力，實際使用中也用過葡萄糖和蜂蜜代替。

1、用于鴿棚及環境消毒

用EM原露，紅糖、加250~500倍水配成稀釋液噴灑鴿舍及周圍環境。開始每星期1次，逐漸減少到15天1次。實際運用中只要把鴿子每天喝剩下的EM稀釋液用來消毒鴿舍即可。鴿子飲用EM原露和鴿舍噴灑EM原露一段時間后，鴿舍中的臭味會大大降低，連蚊蠅也會減少很多，這是由于EM原露中的微生物能把促成惡臭的物質：氨、硫化氫、甲基硫醇等當做食物吃掉（分解掉）這無疑給城市陽臺的養鴿者帶來福音。再不要因為鴿舍產生臭味及引來的蚊蠅與鄰居們發生糾紛，城市文明養鴿將落在實處。

2、用于日常保養及防病

用EM原露，紅糖，加水配成稀釋液給鴿子全天飲用即可，EM原露的用量為每羽信鴿每天0.25~0.5毫升，加水量為100~200倍，以每天剛好飲完為宜論文的格式。原則是冬天增加濃度，夏季減少濃度。其特點是能明顯改善整個鴿群體質，對養功差的鴿舍效果尤其明顯，鴿群抗病能力增強基本上不民生惡性傳染病，消化能力強，糞便形狀好，家飛時間延長，飛徑半徑大，訓放整體歸巢率高，對照使用注射用氨基酸的鴿群，效果毫不遜色，且成本降低十幾倍。

3、防治信鴿體內外寄生蟲

其特點是內服不產生毒付作用，非常安全，同時又起到對鴿子身體的保健作用。因此，在比賽期間也能應急使用。外用洗澡也很有特點，有不少鴿友喜歡用高錳酸鉀（PP粉）溶于水中給鴿子洗澡，雖然也能起到驅蟲，消毒作用，但高錳酸鉀是一種強氧化劑，在殺菌的同時也會加速信鴿羽毛的老化，使其失去光澤而干枯。而EM原露中微生物的特點是能產生抗氧化作用的物質，使用它給鴿子洗澡，既能驅蟲消毒，又能對鴿子的羽毛起到非常好的護理作用。

EM原露可配制成防蟲液，用來驅除鴿子體內外寄生蟲。 鴿子體內驅蟲時用EM防蟲液加500倍水飲用1天生物論文，1星期后再飲用1天即可。驅除體外寄生蟲可用EM防蟲液加1000 倍水給鴿子洗澡，每星期1次，實際應用中用EM原露直接放在水中給鴿子洗澡，也有驅蟲效果，并能使鴿子羽毛油滑光亮。

4、用于治療鴿病

其特點是簡便實用，無論是什么病，不需要做治療前的醫學檢驗，不用擔心會用錯藥，EM原露對鴿子的消化系統疾病，呼吸系統疾病和一些疑難難癥都能治療，特別是對令鴿友最頭痛的多病菌復合有一舉多得的效果，同時EM原露治病沒有其它化學藥劑在治病的過程中產生的毒付作用，抗藥性及二次感染等等一系列后顧之憂。而且用EM原露治好的鴿子身體素質恢復極快，這是由于在鴿病治好的同時，鴿子消化系統也已調整到位，這時給鴿子進行營養補充會得到良好的吸收，使鴿子體質迅速恢復。

⑴如果是全棚發生傳染性疾病，（如沙門氏菌，新城疫球蟲病等）可用EM原露，紅糖，（這時不能使用蜂蜜）加水50倍配成稀釋液全天飲用，觀察鴿子精神狀態及烘便，以此判斷使用效果，一般3~7天即可完全控制病情，如用后2~3天內無明顯效果，可以加大濃度。病情控制后，要繼續按治療濃度飼喂兩天，以便鞏固治療效果，然后恢復日常保養濃度。

⑵對病情比較嚴重或個別發生病情的鴿子，可用EM原露紅糖加水10倍配成稀釋液，用注射器灌服，每次10毫升每日2~3次，對病情特別嚴重的鴿子我們的做法是直接灌服EM原露，每次3~5毫升。

⑶對念珠菌，毛滴蟲，霉菌感染的信鴿，一般口腔中生有黃白色沉積物，這時要先將沉積物去掉，然后在口腔內滴幾滴EM原露，并內服治療濃度的EM原露，一般2~3天以夠治好。

⑷EM原露還可用于防治信鴿飼料的黃曲霉菌中毒，治療各種原因引起的外傷，眼部啄傷，傷口發炎等具有止血預防感染消炎生物論文，快速愈合創口的神奇效果。

5、用于信鴿賽前賽后的調整和老幼鴿的保健

由于EM原露中的微生物能分泌出有機酸、多糖類、多種維生素、抗生素、各種生化酶、氨基酸和氧等有益物質，既可調正各器官的功能延緩細胞衰老，激活T細胞，分解亞硝基化合物及其它有機化合物，又可增加營養，促進對其它營養物質的吸收，從而改善鴿子體內的微生態平衡，使鴿子保持健康的體質。因此EM原露可用于鴿子的育種，種鴿（特別指高齡鴿）配對前15天，每天灌服10毫升，幼鴿出營后7天至出棚，每天灌服3~5毫升，賽鴿參賽前7天開始每天服10毫升，信鴿比賽歸巢后立即灌服20毫升，（此時配羊稀釋液時可用蜂蜜代替紅糖），之后連服3天，然后轉為日常保健濃度飼喂。

注意：在上述調整中，如信鴿出現體重過重，可適當增加信鴿日常訓練的運動量，減少飼料中油脂性飼料的比例，其它添加劑均可不用或少量使用，比賽期間可適當給賽鴿增加營養，可選擇多種維生素和中草藥制劑。

第5篇

【關鍵詞】 雷帕霉素； 肝移植； 冷保存； 再灌注； 膽管上皮細胞； 增殖

【Key words】 Rapamycin; Liver transplantation; Cold preservation; Reperfusion; Biliary epithelial cells; Proliferation

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

兔抗增殖細胞核抗原多克隆抗體、鼠抗pSTAT3tyr705單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司；ChemMateTM Envision免疫組化試劑盒為丹麥Dako公司產品；RPM為美國惠氏百宮制藥公司惠贈。

1.3 各組術后生存分析

1.4 肝功能指標檢測

1.5 兔抗增殖細胞核抗原、α平滑肌肌動蛋白免疫組織化學檢測

肝組織常規固定、包埋、切片。采用兔抗增殖細胞核抗原作為細胞增殖期G1S期的評價指標，α平滑肌肌動蛋白作為肌纖維母細胞標志。按ChemMateTM Envision免疫組化試劑盒說明書操作。顯微鏡下觀察α平滑肌肌動蛋白表達陽性細胞的胞質呈棕色，增殖細胞的胞核呈棕色。計算7個高倍鏡(×400)視野內，每100個膽管細胞中增殖的膽管上皮細胞所占比例的均值作為該樣本的膽管上皮細胞增殖率［4］。

1.6 統計學分析

計量資料以±s表示，所有數據應用SPSS 10.0軟件進行統計分析，多組均數間的比較采用單因素方差分析，采用KaplanMeier法繪制生存曲線，Logrank法檢驗各組生存率之間的差異。

2 結果

2.1 各組術后生存分析

冷保存12 h組生存率明顯低于冷保存1 h組(P=0.017 4)，而與雷帕霉素組水平接近(P=0.89，圖1)。兩組大鼠死亡的主要原因為移植肝肝功能不全，表現為肝臟淤血或伴有局灶性壞死，腹水、黃疸，肝功能酶譜升高，部分死亡大鼠膽管內可見褐色膽泥形成。

圖1 各組肝移植術后生存曲線

2.2 各組肝功能檢測

2.3 各組膽管上皮細胞增殖

2.4 膽管周圍肌纖維母細胞分布

圖2 肝移植術后膽管上皮細胞增殖(紅色箭頭所示為增殖細胞) (2氨基聯苯胺染色 ×400)

圖3 肝移植術后肌纖維母細胞分布(紅色箭頭所示為肌纖維母細胞) (2氨基聯苯胺染色 ×400)

3 討論

殘存的膽管上皮細胞在對損傷做出再生修復時，雖然最終能恢復到近似原先的細胞形態，但在該過程中極有可能經歷DNA損傷或基因序列改變，具有和正常細胞不同的功能，分泌多種與器官纖維化密切相關的細胞因子如TGFβ等，促進膽管周圍成纖維細胞活化轉化為肌纖維母細胞，而后者的持續出現是器官纖維化過程的關鍵［6］。同時，大量而活躍的細胞分裂需要消耗較多的能量，就有可能削弱肝內非新生細胞正常的能量代謝過程［7］。這對移植物的長期存活及功能是不利的。我們觀察到伴隨著明顯的膽管上皮細胞增殖，較多肌纖維母細胞環繞于冷保存12 h組膽管周圍。這表明嚴重冷保存再灌注誘導的膽管上皮細胞增殖可能是促進肌纖維母細胞聚集的重要因素。由于膽管上皮細胞和膽管周圍肌纖維母細胞之間維持著非常精妙的平衡，冷保存再灌注對膽管上皮細胞的嚴重損傷觸發肌纖維母細胞的大量活化，導致膽管壁創面收縮，增加了膽管壁及其周圍組織纖維化和膽管狹窄形成的風險，在肝外膽管或肝內大膽管常表現為管腔狹窄，在小膽管則可能出現管腔阻塞［8］。我們還觀察到大膽管尤其肝門附近大膽管內壁的膽管上皮細胞增殖最為活躍，該區結締組織豐富，內含大量成纖維細胞，極易受到膽管上皮細胞增殖的影響而活化為肌纖維母細胞。這也許正是臨床觀察到的肝門附近大膽管成為移植肝膽道狹窄易患部位的原因之1，也是影響移植物功能與存活的重要因素。

作為1種新型免疫抑制劑，體外和體內實驗均證實雷帕霉素抑制膽管上皮細胞增殖，其有效抑制濃度遠低于臨床肝移植術后患者應用雷帕霉素作為免疫抑制劑時的血藥濃度［9］。我們的研究也發現，雷帕霉素明顯抑制由冷保存再灌注損傷誘導的膽管上皮細胞增殖，并減少膽管周圍肌纖維母細胞的聚集。雷帕霉素是信號轉導及轉錄激活因子3活化的特異性抑制劑，因而部分阻斷轉錄激活因子3介導的信號通路，從而調控細胞周期進展，影響細胞增殖與分化［10］，這可能是其抑制膽管上皮細胞增殖的分子機制之1。同時我們還觀察到，雷帕霉素雖然明顯抑制肝移植術后膽管上皮細胞的增殖，但并未降低術后14 d內生存率，進1步提示以膽管上皮細胞增殖為靶點的雷帕霉素極可能成為臨床防治移植肝膽管周圍纖維化、膽管狹窄等并發癥的有力武器，將會更廣泛地應用于肝移植領域。

【參考文獻】

［2］ Ramadori G, Saile B. Portal tract fibrogenesis in the liver. Lab Invest,2004,84(2):153-159.

第6篇

關鍵詞： 種植體頸部 細菌特點 抗菌技術

在種植修復中，種植體頸部的軟組織封閉對種植體成功率有很大的影響。要獲得良好的頸部軟組織封閉，應該從種植手術后的組織愈合期開始為種植體周圍軟組織提供一個既有相對無菌的微環境，且又有便于細胞粘附的材料表面。有學者【1】開始研究納米抗菌材料對人牙齦細胞的增殖和粘附生長的影響。研究結果顯示HGF在含10mg/L和100mg/L納米抗菌材料溶液中持續培養5天，未見其生長與增殖受到明顯影響。在l0mg/L和100mg/L濃度的納米抗菌材料溶液中培養5天的HGF，其亞細胞超微結構正常，胞體內可見吞噬小體，吞噬小體周圍膜性結構完整。涂布納米抗菌材料的表面和光滑純鈦表面上人牙齦成纖維細胞的粘附生長增殖活性差異沒有統計學意義（p>0. 05 ），但在掃描電鏡中可見涂布納米抗菌材料的表面人牙齦成纖維細胞有分層生長趨勢。綜上所述，納米抗菌材料對人牙齦成纖維細胞的生長與增殖無抑制作用，納米抗菌材料涂布的表面更有利于人牙齦成纖維細胞的粘附。

又有學者【2】研究氟離子注入鈦表面對骨細胞相容性和抗菌性的影響發現氟離子注入表面改性材料沒有細胞毒性，利于成骨細胞在其表面的粘附和增殖，，氟離子注入組材料表面成骨細胞粘著斑形成的數量明顯多于純鈦組表面，氟離子注入組材料表面成骨細胞I型膠原蛋白形成的數量明顯多于純鈦組表面，差異有統計學意義。氟離子注入組材料表面成骨細胞I型膠原mRNA和I型膠原蛋白的表達明顯高于純鈦組表面，差異有統計學意義。

有學者發現【3】在口腔生態環境中種植義齒與天然牙牙頸部主要存在18種優勢菌，兩者無顯著差異，其中需氧菌主要為草綠鏈球菌、卡雙球菌等7種，厭氧菌主要為產黑色素類桿菌（占厭氧菌總數的一半以上達56.9%）、口腔類桿菌等11種。齦袋分泌物細菌培養分類計數顯示，產黑色類桿菌的數量明顯高于種植牙和天然牙頰面頸部的數量達79 %，兩者間有顯著性差異。產黑色類桿菌是引起牙周炎的主要病菌之一，當其數量與口內其它菌群保持特定的平衡關系時，即可保持口腔生態環境的相對穩定，維持牙周組織健康，進而發揮或恢復牙或種植體正常的生理功能。如因某種原因造成這種平衡關系的破壞，就會產生牙周致病菌的大量增生，這些致病細菌及其產物就可通過主生細菌酶及菌體內毒素而破壞牙周組織。

口腔微環境是細菌適宜的棲息地，大約有700余種細菌構成了一個復雜多樣的口腔微生態系統 。其中大約10—20種在破壞性牙周病發病中起作用。目前認為最可疑的牙周致病菌有：伴放線放線桿菌（aa）、牙齦卟啉單胞菌（Pg）、中間普氏菌（Pi）、具核棱桿菌（Fn）等 。研究發現【4】種植體植入后30 分鐘即有細菌定植 。早期種植體表面未檢測到Aa和Pg兩種重要牙周致病菌 ，其余可疑牙周致病菌均有發現。健康的種植體周圍球菌的比例較高，厭氧菌和需氧菌的比例較低，牙周致病菌較少檢測到。而失敗的種植體周圍卻檢測到大量的Aa和Pi，特別是在牙列部分缺失的病人。已有研究表明，種植體周圍炎同革蘭陰性桿菌相關，包括類桿菌和梭桿菌，螺旋體也在種植體周圍炎的發病區域被發現。姜梅杰等【5】通過檢測126例患者種植體周菌群，檢測出兩種新的口腔厭氧菌，即產黑色素普雷沃氏菌和溶血二氧化碳噬纖維菌，檢出率分別是54.0% 和31.7%。

學者【6】發現種植體周圍的上皮組織也同天然牙一樣，由齦溝上皮和結合上皮構成。齦溝上皮構成了種植體防御口腔食物分解產物及細菌、毒素等有害物質侵襲的第一道屏障，這種保護作用不同于一般物理學的封閉，而是類似于一種動態的生物性濾膜（bio-logical filter）。而結合上皮與種植體的緊密附著，構成了軟組織防御系統的第二道屏障。種植體周牙齦上皮由數層上皮細胞構成，并形成上皮釘突，細胞之間有較寬的細胞間隙。一些學者利用組織化學的方法對種植體上皮界面進行進一步研究發現，結合上皮與種植體之間存在一層無定形物質，鑭鹽、過腆酸希夫氏（PAS）染色陽性，提示存在酸性粘多糖和糖蛋白，而酸性粘多糖和糖蛋白正是基底膜的成分之一。底部上皮的細胞厚度為2-5層。

有研究表明【7】種植系統基臺的表面粗糙度與菌斑形成密切相關，粗糙的種植體表面常有較多的成熟菌斑，其內含高比例的能動菌和螺旋體 。通常金屬表面粗糙度以Ra與Rz值表示，種植體表面光滑度（Ra值）范圍0.1～0.3 m，相當于光滑的釉質表面和打磨光滑的修復體。Ra=0.2 txm為表面粗糙閾值，Ra0.2 m時，表面黏附的細菌則明顯增加 。Lia等【8】 曾將3種不同粗糙度的純鈦片戴入病人口腔中，24 h后測定細菌的黏附量：Ra≤0.0887 m、Rz≤1.027 Jn時，可以有效減少菌斑的形成。Quirynen等【9】 則把純鈦基臺用不同的方法拋光處理后戴人病人口中，結果顯示，當Ra

參考文獻：

【1】馮琦 納米抗菌材料對人牙齦成纖維細胞生物學行為影響的體外實驗研究 四川大學華西口腔醫學院碩士學位論文

【2】劉慧穎 氟離子注入欽表面對骨細胞相容性和抗菌性的影響中國醫科大學博士學位論文20080301

【3】劉渝王莉 種植義齒牙頸部細菌生長附著的研究 中國口腔種植學雜志2000年6月第5卷第2期

【4】作者：廖麗斐（綜述），鐘科，孫 勇（校審） 影響種植體周微生物的因素 西南國防醫藥2010年10月第20卷第l0期

【5】姜梅杰 郝巧光 王軍 人工種植義齒齦溝物厭氧培養結果分析1999（03）

【6】次仁頓珠 姚冬花 結合上皮和結締組織：種植體與軟組織的結合界面及其影響因素 醫藥雜志2011年第32卷第1期（總第106期）

【7】宿玉成 現代口腔種植學2004

【8】Lia R；Silcia F；Eugenio B The effect of surface roughness on early in vivo plague colonization on titanium1997

第7篇

1PCNA的特點

PCNA是一種分子量為36KD的蛋白質，在細胞核內合成，并存在于細胞核內，為DNA聚合酶δ的輔助蛋白。在細胞核內存在可溶性與不溶性兩種PCNA，可溶性PCNA在細胞周期各期中均有表達，其量在DNA合成過程中不發生明顯變化，易被去污劑提取、甲醇破壞；不溶性PCNA較穩定，不易被去污劑洗脫、甲醇破壞，這種PCNA在G0～G1期細胞中無明顯表達，G1晚期，其表達大幅度增加，S期達到高峰，G2～M期明顯下降，其量的變化與DNA合成一致，檢測其在細胞中的表達，可作為評價細胞增殖狀態的一個指標[1,2,4]。

2腫瘤中PCNA的研究

腫瘤細胞具有旺盛的增殖活性，而PCNA可作為評價細胞增殖狀態的指標。因此，國內外在許多腫瘤中進行了PCNA的研究，涉及PCNA與腫瘤發生發展[5,6]、分級[1,7～10]、分期[1,10]、放療敏感性[11,12]、預后[1,7,8,10,13～20]、復發和轉移[1,21]、死亡原因[20]、腫瘤標志物[18,22]等各個方面的相關性，得出了許多結論，但在某些方面因作者和所研究腫瘤的不同，還存在一些爭議，即使尚沒有爭議的結論，也是從一種或幾種腫瘤中得出的，這些結論是否適用于所有腫瘤，仍有待進一步研究。

3肺癌中PCNA的研究

PCNA在肺癌中的研究也較多，許多作者致力于這方面的探討，期望找到有意義、有價值的結果，但到現在為止，PCNA在肺癌中研究所得出的一些結果也同樣存在爭論[23]。

3.1PCNA與肺癌發生發展的關系

夏書月等[6]在研究肺鱗癌的發生、發展過程中，發現PCNA的表達有逐漸增高，陽性細胞數逐漸增多的趨勢。在輕、中、重度不典型增生、原位癌及浸潤癌中，PCNA標記指數分別為12.5±8.7、43.3±14.9、68.1±9.1、74.6±8.2、65.4±23.6，與正常和輕、中度不典型增生的上皮相比，浸潤癌、原位癌和重度不典型增生的上皮細胞PCNA標記指數明顯升高，PCNA陽性細胞數也明顯增多。認為PCNA表達為細胞異常增殖的標志，可作為肺鱗癌早期診斷的參考指標。但這僅是在肺鱗癌中的初步探索，且病例數較少，能否作為肺鱗癌早期診斷參考指標，還需進一步驗證。

3.2PCNA與肺癌分型的關系

有作者[15,24]認為PCNA在不同類型肺癌中表達不同，鱗癌PCNA標記指數平均約為52％，腺癌為49％，大細胞肺癌為76％，小細胞肺癌為63％。何杰等[25]的結果為：肺鱗癌標記指數為0.51±0.23，腺癌為0.69±0.34。在同一類型不同亞型之間也表達不同。王恩華等[13]在86例肺腺癌中對各亞型進行分析：PCNA在細支氣管肺泡癌中表達約為0.22±0.17，腺泡狀腺癌中約為0.36±0.12，大細胞癌中約為0.67±0.10。但也有作者認為PCNA的表達僅能反映細胞的增殖狀態，與組織學類型無關。Castellano[26]、Fontanini[14]、Fujii[27]等支持這種觀點。

3.3PCNA與肺癌分化程度的關系

有研究表明：PCNA表達隨肺癌分化程度的增高而減少。王恩華[13]在肺腺癌的研究中發現：高分化組最低，PCNA標記指數約為0.19±0.10，中分化組稍高，約為0.35±0.10，低分化組最高，約為0.55±0.17；何杰等[25]分別分析了肺鱗癌、肺腺癌中PCNA的表達，發現PCNA標記指數與腫瘤分級呈正相關，Zhao等[28]在73例肺癌中得出了同樣結論。可見肺癌中PCNA的表達可反映肺癌細胞分化的好壞，預示腫瘤惡性度的高低。這與在許多種其他腫瘤中的研究發現基本一致。

3.4PCNA與肺癌分期的關系

大多數研究表明：PCNA表達與肺癌分期相關，分期愈晚，PCNA表達愈高。Ishida等[29]在211例非小細胞肺癌中統計出Ⅰ、Ⅱ、Ⅲa、Ⅲb期各期PCNA表達平均值分別為30％、24％、40％、50％，有逐漸增高的趨勢，但Ⅰ、Ⅱ期差別不大。王恩華等[13]的研究也認為，肺癌中PCNA的表達與N分期及M分期相關，隨著分期的增加，PCNA表達增加。但也有作者持相反意見，Fontanini等[14]在周圍型非小細胞肺癌的研究中發現，PCNA的表達與分期無關，他們的結果為：T1期PCNA表達值平均約為18％，T2期約為10％。是否是由于在早期（Ⅰ、Ⅱ）肺癌中PCNA表達受宿主免疫系統抑制，變化不明顯，而晚期肺癌因免疫抑制減弱，表達明顯增加，還有待繼續探討。

3.5PCNA與肺癌血管受侵的關系

Fontanini等[14]在40例周圍型，淋巴結陰性的非小細胞肺癌(NSCLC)中發現：PCNA的表達與血管受侵明顯相關，有血管受侵組的PCNA表達明顯高于無血管受侵組，平均值分別為40％和10％。Fujii等[27]也發現PCNA表達與肺癌血管受侵明顯相關。這可能與PCNA高表達者分化差，惡性度高，容易侵蝕血管有關。

3.6PCNA與肺癌預后的關系

部分作者認為：PCNA表達愈低，其生存時間愈長，預后愈好。王恩華等[13]分析了86例手術切除的肺腺癌病例，發現術后存活3年以內組與5年以上組之間，PCNA表達值有顯著差異，其標記指數分別為0.42±0.20和0.22±0.15;Ishida等[29]在Ⅰ期NSCLC中也發現，5年生存組中，PCNA(＋)組生存率明顯低于PCNA(－)組；Fujii等[26]的研究結果也支持這種觀點。但有相當多的作者認為單憑PCNA不能評價NSCLC的預后，Matturri[30]、Monraval[31]、Castellano[26]、Ebina[32]等各自分別研究了PCNA的表達與術后NSCLC生存時間的關系，沒找到明確的相關性。考慮這是由于肺癌的預后是由多種因素：如病理類型、病理分期、分化、治療情況、合并癥、年齡、身體狀況、PCNA的表達等綜合決定的，單憑PCNA這一種因素，難以預測肺癌的預后。

3.7PCNA與肺癌復發的關系

Ogawa等[33]在35例術后復發的Ⅰ期NSCLC中發現，PCNA(＋)組復發時間明顯短于PCNA(－)組，中位無瘤生存時間分別為2.5年和4年，認為PCNA可預測Ⅰ期NSCLC術后復發時間的長短。但所研究病例太少，范圍狹窄，結果有待進一步證實。

3.8PCNA與肺癌其它標志物的相關性

Fontanini等[14]在周圍型肺癌中發現PCNA表達在DNA異倍體中明顯高于DNA整倍體，并與異倍體DNAS期分數明顯相關，PCNA表達高的分裂指數高于PCNA表達低的。還有研究[13,15,24,28,29,34]表明肺癌中PCNA的表達與細胞構成、DNA指數、AgNORs計數、Ki67等相關。這些多為首次報道，不知結果能否重復，若結論能確證，則無論在臨床上，還是基礎研究中，PCNA的應用和研究將會更為廣泛。

從上可見，肺癌中PCNA的研究已深入到了肺癌的各個方面，但在許多方面所得結果還不統一，造成這種結果不一致的原因很多，初步分析包括以下諸多因素：1)腫瘤本身的因素：腫瘤與腫瘤之間及同一腫瘤不同部位之間，細胞增殖都存在很大的差異[26,36,37]，致使PCNA表達不均。2)取材的影響：由于腫瘤內部不同部位之間PCNA表達不均，取材時可能取到高表達區，也可能取到中表達區或低表達區，以致計數結果不能代表整個腫瘤情況。3)制片過程中的影響因素：組織固定時福爾馬林的濃度，固定時間的長短，烤片時溫度高低及烤片時間等對PCNA的抗原性都有影響。固定液濃度過高，固定時間過長，烤片溫度過高，烤片時間過長均會降低PCNA的抗原性乃致使抗原性消失[1,2]。4)免疫組化染色過程中的影響因素：免疫組化染色過程中所用抗體不同，所得PCNA結果不同；微波爐加熱能恢復PCNA的抗原性，增強切片的免疫組化染色效果[37]，使用微波爐處理切片，能增加檢測的數值；另外抗體的滴度，內源性過氧化物酶封閉情況，DAB顯色時間長短，蘇木素襯染的背景深淺等均會影響染片的效果，產生假陰性或假陽性，使檢測結果發生變化。5)結果判斷的影響：由于每個人所定的陰陽性染色標準不同，選取視野不同，計數細胞總數不同，也造成了一定的人為偏差。

由于實驗中存在以上諸多影響因素，不同作者在肺癌中所研究出的結果或在不同腫瘤中所研究出的結果，都難以對照相比，因此PCNA的免疫組化研究有必要采用統一的標準，減少實驗誤差和人為偏差，使彼此的結果具有可比性。

總之，無論在整個腫瘤方面，還是單在肺癌這一方面，PCNA的研究都是較多的，得出了許多有臨床應用價值的結果，但由于腫瘤本身的變異性及人們研究方法的差異，致使所得結果存在一些爭議，這有待進一步驗證，以便能達到一致的結論，應用于臨床，指導臨床實踐。

作者單位：劉躍平綜述汪楣沈瑜殷蔚伯中國醫學科學院腫瘤醫院放療科北京市100021

參考文獻

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第8篇

[關鍵詞] 胎盤 細胞凋亡 bcl-2 bax ki67

[論文] 人類胎盤不僅在胎兒—胎盤—母體的關系上起中心軸的作用，而且功能上失調會導致母體和胎兒的病理性變化，隨著妊娠的進展，絨毛和滋養層不斷成熟和分化，已發現許多物質包括原癌基因產物，在胎盤有生理性的表達。胎兒的發展特征是細胞群增殖和誘導或抑制細胞凋亡成熟起來的，因此，胎盤在妊娠期間也經歷著相似的變化。我們通過測定胎盤組織中細胞凋亡調控基因bcl-2、bax及細胞增殖基因ki67，進一步探討了妊娠高血壓綜合征（PIH）的病理性變化。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 隨機選擇1998年11月至1999年4月白求恩醫科大學第二臨床醫院及長春市婦產醫院婦科門診及產科病房的孕產婦66例。（1）妊高征組36例，平均26.14±3.42歲，平均孕37.44±3.9周，輕度9例，中度10例，重度17例；(2)正常妊娠組30例，孕早期10例，平均25.25±3.80歲，平均孕9.03±1.11周；孕中期5例，平均26.55±3.93歲，平均孕24.05±3.63周；孕晚期（對照組）15例，平均27.76±3.38歲，平均孕39.82±1.32周。

1.2 標本采集及處理 孕早期是行人工流產術者，孕中期是來自無妊娠合并癥、并發癥，要求終止妊娠而行水囊引產者，孕晚期為單胎足月初產婦，無妊娠合并癥、并發癥、以自然分娩及擇期剖宮產手主結束分娩，其剖宮產指標主要是頭盆不稱及社會因素。妊高征組孕婦是無慢性高血壓、慢性腎炎及其它心腎疾病的病史者。

早孕絨毛組織不需進一步處理，取出后用生理鹽水沖洗凈，即用10%福爾馬林液固定。中、晚期胎盤組織于分娩后立即在母體面（避開鈣化、機化灶）隨機取3個不同區域約2cm×2cm×2cm胎盤組織，生理鹽水沖洗干凈后立即放入10%福爾馬林固定液中。

1.3 方法 用免疫組化SP法，抗bcl-2、抗bax、抗ki67單克隆抗體即用型及SP試劑盒均購自福州邁新生物工程公司。每次染色均設陽性和陰性對照。

1.4 結果判定 由2名醫師獨立觀察切片中10個高倍視野。（1）陽性標準：SP法顯示bcl-2及bax定位于胞漿和胞膜內，反應產物為棕黃色。根據顯色程度分為4級：（-）為無著色，（+）為淡黃色，（++）為棕黃色，（+++）為棕褐色;（2）SP法顯示ki67以細胞核呈清晰棕褐色為陽性，按陽性細胞占C-cells的比例分為：陽性細胞數＜10%為（-）；10%-20%為（+）；20%-30%為（++）；＞30%為（+++）。

1.5 統計學分析Fisher精確概率檢驗法，兩組計數資料用等級相關分析。

2 結果

2. 1 正常妊娠期胎盤組織中bcl-2、bax及ki67的基因表達bcl-2表達主要定位在絨毛的S-cells，而bax在S-cells和C-cells均呈陽性，同時在絨毛間質中bax也呈陽性表達，但強度低于滋養層細胞；ki67蛋白主要定位在C-cells。bcl-2在晚期妊娠組的陽性率明顯低于早、中期妊娠組（P＞0.05）；ki67在晚期妊娠組的陽性率明顯低于早、中期妊娠組（P＜0.01）。早、中、晚期妊娠組bcl-2的表達強度與ki67的表達強度無相關性（P＞0.05），bax與ki67也無相關性（P＞0.05）。

2 .2 妊高征與正常晚期妊娠胎盤組織中bcl-2、bax及ki67的基因表達bcl-2的陽性率在對照組與PIH兩組間差異無顯著性（P＞0.05），bax兩組差異無顯著性（P＞0.05），對照組ki67的陽性率明顯低于PIH組（P＜0.01）。bcl-2與ki67的表達強度無相關性（P＞0.05），bax與ki67也無相關性（P＞0.05）。

2.3 妊高征胎盤組織中bcl-2、bax及ki67的基因表達bcl-2的陽性率在輕、中、重度PIH3組間差異無顯著性（P＞0.05），bax在3組間差異也無顯著性（P＞0.05），而ki67在輕度PIH組的陽性率明顯低于中、重度組（P＜0.01）。PIH輕、中、重度組妊娠bcl-2的表達強度與ki67的表達強度經等級相關分析無相關性（P＞0.05），bax與ki67也無相關性（P＞0.05）。

3 討論

3.1 正常妊娠與妊高征胎盤組織bcl－2、bax的基因表達bcl－2是細胞凋亡的重要抑制基因。本研究中免疫組化已確定bcl－2定位在S－cell表達，并且從正常早孕到晚期妊娠持續出現[3，6]，因此保留滋養層細胞團可能是維持妊娠的一種機制[1]。晚期妊娠bcl－ 2表達下降、可能是因為bcl－2正常生理性功能，在孕晚期組成胎盤的細胞不再需要存活，可能是細胞凋亡的一種早期生物學變化，也可能與分娩有關[2]。

目前已知bcl－2和bax是bcl－2家族中重要成員。bcl－2表達水平較高時，可形成bcl－2和bax的異源二聚體，細胞凋亡受到抑制； bax表達水平較高時，可形成bax－bax同源二聚體，加速細胞凋亡。本研究中，對照組bcl－2與bax的陽性率為66．7％與80％，PIH組的陽性表達均為75％，表明大多數胎盤組織均呈bcl－2與bax高表達。bcl－2和bax表達已在一定水平上達到平衡，所以在胎盤組織中不起介導細胞凋亡的主導作用。

PIH組的bax并無隨病情的嚴重程度而有下降的趨勢，說明bax會進一步影響妊娠的結局，反映病情的嚴重程度。這些結果可能提示，胎盤的細胞凋亡并不是bax單獨起作用，但有待進一步證實。

第9篇

【關鍵詞】MicroRNA；癌細胞；抑癌基因；癌基因

1 MicroRNA的介紹

MicroRNA一般簡寫作miRNA ，是一種21-25nt長的單鏈小分子RNA，成熟的miRNA，5’端有一個磷酸基團，3’端為羥基。它廣泛存在于真核生物中，是一組不編碼蛋白質的短序列RNA。編碼miRNAs的基因最初產生一個長的pri-RNA分子，這種初期分子被剪切成約70-90個堿基大小、具發夾結構的單鏈RNA前體，并經過Dicer酶加工后生成。成熟的miRNA 5’端的磷酸基團和3’端羥基則是它與相同長度的功能RNA降解片段的區分標志。

目前只有一小部分miRNAs生物學功能得到闡明。這些miRNAs調節了細胞生長，組織分化，與生命過程中發育、疾病有關。通過對基因組上miRNA的位點分析，顯示其在發育和疾病中起了非常重要的作用。而最近的研究發現，miRNA表達與多種癌癥相關，大約50%得到注解的miRNAs在基因組上定位于與腫瘤相關的脆性位點，這說明miRNAs在腫瘤發生過程中起至關重要的作用。同時據推測，miRNA調節著人類1/3的基因。

2 癌細胞的介紹

癌細胞是一種產生了變異的細胞，可以無限生長、轉化和轉移，能夠無限增殖并破壞正常的細胞組織，難以消滅，它是癌癥的根源。

大部分細胞的分裂次數是有限的，即“海弗利克極限”。在分裂40-60次之后，細胞的生長速度會下降直至終止，這時細胞就進入衰老期，但是依然存活。這是由于細胞分裂跟端粒有關，如果沒有端粒，細胞每分裂一次染色體都會變短，基因信息就會缺失。但是如果存在端粒，每次細胞分裂都會損失端粒的一部分核苷酸，而正常細胞中沒有端粒酶，不能正常合成端粒，隨著細胞分裂的進行，最后就沒有端粒可以保護染色體的末端DNA，所以正常細胞會衰老死亡。而癌細胞中有端粒酶，可以在染色體末端增加端粒DNA。

3 充當抑癌基因作用的miRNA

3.1 MicroRNA-486對肺癌細胞的抑制作用

由俄亥俄州立大學綜合癌癥中心研究人員Ohio State等人帶領完成的一項發表在《美國國家科學院院刊》雜志上的最新研究表明，在肺癌中，microRNA-486是一種強效的抑癌分子，它調節肺癌細胞的增殖和遷移，并誘導程序性細胞死亡或凋亡，但是其在肺癌中的作用機制尚不清楚。

研究人員證實microRNA-486（miR-486）能直接靶向胰島素樣生長因子途徑（胰島素樣生長因子是一類多功能細胞增殖調控因子，在細胞的分化、增殖、個體的生長發育中具有重要的促進作用），這一途徑對于細胞的存活和增殖具有重要意義，并且研究也表明這一途徑發生改變，對于早期腫瘤的發生和發生具有影響。

3.2 miRNA-224及221對大腸癌細胞的生長和轉移的抑制作用

大腸癌（colorectal cancer，CRC）又稱結直腸癌，是目前在臨床上非常常見的一種腫瘤，在國內的發病率處于第三位，而且其發病率仍呈逐漸上升的趨勢，是一種導致人死亡的重要疾病。人們對于大腸癌認識不足，因此在臨床上發現的大腸癌多數為中晚期腫瘤，治療效果差，復發率高。

由來自四川大學、美國北達科他大學的研究人員發表在在國際胃腸病學雜志上的論文表明，miR-224及miR-221過客鏈水平降低，通過上調MBD2，抑制Maspin，促進了小鼠體內的大腸癌生長和轉移，它們有潛力成為大腸癌進程的生物標記物，并為開發出靶向性治療指明了新方向。

3.3 MicroRNA-10a對肝癌細胞的抑制作用

肝癌是一種嚴重威脅人類健康的疾病，病死率在惡性腫瘤中居第3位。它的發病因素可能是乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）引起的肝炎、肝硬化以及黃曲霉素、化學致癌物等其他因素。

來自天津醫科大學和中山大學癌癥中心的研究人員發表在在國際著名肝臟疾病雜志Hepatology上的論文表明：一種名為MicroRNA-10a的miRNA通過調控EphA4受體介導的上皮間質轉化和細胞粘附，參與了肝癌細胞轉移過程。

3.4 MicroRNA-7對胃癌細胞轉移的抑制作用

胃癌在我國各種惡性腫瘤中居首位，轉移是臨床上成功治療胃癌的一大障礙，大多數胃癌患者的死亡率與轉移密切相關，而microRNAs通過調控多種信號通路已成為影響轉移的關鍵因子。在Oncegene雜志上的一項研究表明證實在高轉移性胃癌細胞株和腫瘤轉移組織中miR-7的表達都顯著下調，miR-7表達的增加能降低胃癌細胞的遷移和侵襲能力，而miR-7表達的降低能顯著增強腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。

4 充當癌基因作用的miRNA

4.1 miR-17-92 基因簇作為致癌基因誘導腫瘤發生

現已發現，miR-17-92 基因簇在肺癌、B 細胞淋巴瘤、外套細胞淋巴瘤、肝癌、前列腺癌、胃癌等多種腫瘤細胞中均高表達，而且在淋巴瘤、肺癌等多種癌細胞中均存在 miR-17-92 基因擴增現象，其主要是通過抑制抑癌基因和細胞周期調控基因的表達實現的。

4.2 miR-21可能作為膠質母細胞瘤的癌基因

膠質母細胞瘤是星形細胞腫瘤中惡性程度最高的膠質瘤，患者預后差，95%未經治療的患者生存期不超過3個月，對人類的危害很大。

據研究表明miR-21在包括膠質瘤在內的多種腫瘤中高表達，由此表明其可能是癌基因。研究表明，利用互補寡核苷酸抑制惡性膠質瘤細胞的內源性miR-21的功能將導致caspase（Caspase與真核細胞凋亡密切相關，并參與細胞的生長、分化與凋亡調節）的活性增加，并導致細胞活性減低。此外，抑制miR-21的功能可以協同增強惡性神經膠質瘤細胞對細胞毒素NPC-S-TRAIL的敏感性。

5 結論與展望