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第1篇

關(guān)鍵詞硫胺素焦磷酸核酶開關(guān)； 增強綠色熒光蛋白； 基因表達調(diào)控； 熒光生物傳感器； 哺乳細胞

1引 言

核酶開關(guān)是近些年出現(xiàn)的一種人工基因調(diào)控開關(guān)。常見的核酶開關(guān)由錘頭狀核酶和適配體組成[1]。作為一種順式作用元件，在特異識別適配體的配體作用下，無需蛋白質(zhì)輔助，即可通過調(diào)節(jié)自身裂解反應(yīng)，調(diào)控mRNA的翻譯，已應(yīng)用于多種細胞的基因調(diào)控[2～6]。迄今，隨著指數(shù)富集配基系統(tǒng)進化技術(shù)（SELEX）[7]技術(shù)發(fā)展，越來越多的適配體被篩選出來，能特異性地結(jié)合小分子、蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、抗生素和金屬離子等各種配體[8～11]。相比于天然的核酶開關(guān)，人工核酶開關(guān)具有基因表達可控性、結(jié)構(gòu)可組裝性、靶基因特異性等特點[12]。配體與適配體區(qū)的結(jié)合引起的構(gòu)象變化可用來調(diào)控下游基因的表達，轉(zhuǎn)化成相關(guān)的化學(xué)信號，如報告基因的熒光變化等，可實現(xiàn)對配體在活細胞內(nèi)的原位、可視化檢測。如今，合成生物學(xué)的發(fā)展及核開關(guān)在邏輯門中的運用，更推動了基于核酶開關(guān)的生物傳感器在真核細胞內(nèi)的廣泛應(yīng)用[13]。

硫胺素焦磷酸（Thiamine pyrophosphate，TPP） 是維生素B1在細胞內(nèi)的主要活性形式，也是糖、脂肪酸和氨基酸氧化代謝中重要的輔助因子，對維持細胞正常代謝、細胞生長和增殖等發(fā)揮極其重要的作用。TPP 核酶開關(guān)是唯一同時存在于原核生物和真核生物中的天然核糖開關(guān)，在植物和真菌中較為常見[14～17]。其在真核細胞中主要作用于premRNA的內(nèi)含子剪切，可實現(xiàn)對基因精確和有效的調(diào)控。無論是在真核中，還是原核生物中，TPP核酶開關(guān)對TPP都有高的特異性和親和力，而細胞中的其它組分或相似產(chǎn)物與核酶開關(guān)適配區(qū)結(jié)合能力很弱[18～20]，對核酶的活性影響很小。文獻[21～24]報道，將TPP適配體與天然核酶組裝成人工的TPP核酶開關(guān)，用于體外、原核細胞或藻類等細胞中調(diào)節(jié)靶基因的表達。目前，在哺乳細胞中運用的核酶開關(guān)適配體結(jié)構(gòu)多限于茶堿、四環(huán)素、金屬離子等配體的適配體[25，26]。這些配體為細胞外源物，且常具有一定細胞毒性。而TPP是真核細胞的一種重要的代謝中間物，在細胞體內(nèi)含量較低，人工建立的核酶開關(guān)用于調(diào)節(jié)哺乳細胞內(nèi)的基因表達還未見報道。

迄今為止，原核生物中報道的人工TPP核酶開關(guān)有正調(diào)控和負調(diào)控兩種類型[21]，一般置于靶基因5′端。通過配體與適配體的作用，調(diào)控核酶剪切與否，釋放或封閉RBS序列以促進或關(guān)閉下游基因的表達[27]。真核生物中因無RBS 序列，核酶開關(guān)通過抑制mRNA剪切上調(diào)靶基因的表達，或激活mRNA剪切來抑制靶基因的表達[28，29]。目前，人工核酶開關(guān)的設(shè)計一般通過理性設(shè)計通信模塊元件序列，再整合到細菌或酵母mRNA中進行功能篩選與優(yōu)化[30，31]。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

Eppendorf mastercycler nexus PCR儀（德國Eppendorf公司）； Nikon ECLIPSE TI倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）； BD Accuri C6流式細胞儀（美國BD公司）。

焦磷酸硫胺素（>95.0%，美國Sigma公司）； 茶堿（>99.0%，北京百靈威科技有限公司）； DpnI酶（50 U/μL，美國NEB公司）； T4 連接酶（5 U/μL，美國Invitrogen公司）； lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、DMEM培養(yǎng)基（美國Invitrogen公司）； 小牛血清（美國Gibco公司）。

2.2哺乳細胞中TPP核酶開關(guān)質(zhì)粒的構(gòu)建

將來源于Schistosoma mansonii錘頭狀核酶 （HHR） 序列插入pEGFPN1載體EGFP基因的3′ UTR 區(qū)。 pEGFPN1質(zhì)粒為模板，5′ 重疊延伸PCR方法構(gòu)建無TPP適配體區(qū)的pEGFPHHR。PCR反應(yīng)： 94℃預(yù)變性2 min，94℃ 30 s， 60℃ 30 s， 72℃ 1 min， 25個循環(huán)； 72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)體系： 5 μL 10 × Phusion DNA polymerase buffer， 4 μL 10 mmol/L dNTP， 2 μL 10 μmol/L primer F， 2 μL 10 μmol/L primer R， 1 μL Template， 0.25 μL Phusion DNA polymerase； 加ddH2O至50 μL。PCR產(chǎn)物用乙醇回收，DpnI酶37℃消化PCR產(chǎn)物中過量的質(zhì)粒模板1 h，用乙醇回收產(chǎn)物，T4 DNA ligase連接轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞，后涂布至含有相應(yīng)抗性的LB平板中37℃過夜培養(yǎng)。挑取單克隆培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并送上海生工生物技術(shù)公司測序，GenBank中BLAST序列比對。測序成功產(chǎn)物作為模板用于后續(xù)帶有TPP適配區(qū)on/off型核酶開關(guān)的構(gòu)建，其構(gòu)建方法同上，其序列與相關(guān)引物見表1。所有寡核苷酸及引物由上海生工生物技術(shù)公司合成。

2.3哺乳細胞的培養(yǎng)及瞬時轉(zhuǎn)染

HEK293細胞于添加10% 小牛血清的DMEM中，37℃， 5% CO2培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前一天，以5×104/孔密度，添加0.5 mL DMEM/孔鋪于24孔板。根據(jù)轉(zhuǎn)染條件，以每孔1 μg pEGFPTPPHHR質(zhì)粒與2 μL lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染細胞，pEGFPN1與pEGFPHHR分別為陰性與陽性對照，4 h后換新鮮培養(yǎng)基并添加不同梯度濃度（0～150 μmol/L）的TPP或茶堿（Theophylline）。

2.4轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)EGFP表達的熒光顯微鏡觀察與流式細胞儀分析

細胞轉(zhuǎn)染48 h后， PBS洗滌，熒光顯微鏡下以488 nm 激發(fā)波長，515～545 nm發(fā)射波長觀察EGFP

3結(jié)果與討論

3.1pEGFPTPPHHRON/OFF質(zhì)粒的構(gòu)建

人工TPP核酶開關(guān)有正調(diào)控和負調(diào)控兩種類型，無論對于原核生物或真核生物，人工核酶開關(guān)上調(diào)或抑制表達的關(guān)鍵取決于連接適配體結(jié)構(gòu)域與核酶結(jié)構(gòu)域的通信模塊，即連接適配體區(qū)（Stem Ⅲ）與錘頭狀核酶（HHR）（圖2A）莖環(huán)結(jié)構(gòu)（StemⅡ）之間的寡核苷酸序列，故TPP適配區(qū)與HHR核酶的接頭序列是決定核酶開關(guān)是“Switch on”還是“Switch off”的關(guān)鍵。在負調(diào)控（Switch off）開關(guān)中，無配體時，錘頭狀核酶（HHR）的活性結(jié)構(gòu)得不到維持，從而抑制HHR核酶的剪切。而TPP配體的結(jié)合，可引起核酶開關(guān)莖環(huán)結(jié)構(gòu)Stem Ⅱ與Stem Ⅰ 之間活性結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，剪切發(fā)生。反之，正調(diào)控（Switch on）結(jié)構(gòu)具有初始穩(wěn)定的HHR剪切結(jié)構(gòu)，而TPP的結(jié)合反而破壞了HHR的活性結(jié)構(gòu)，從而抑制剪切的發(fā)生[21，23]。根據(jù)原核生物中優(yōu)化的連接適配體與核酶的6個寡核苷酸的不同序列，共構(gòu)建了3種Off（pEGFPTPPHHRoff1，2，3）開關(guān)及兩種On（pEGFPTPPHHRon1，2）開關(guān)的質(zhì)粒（圖2B）（后續(xù)以TPPHHRon/off簡稱）。

為保證其在真核生物中的調(diào)節(jié)活性，所有開關(guān)設(shè)計均插入在目的基因EGFP 3′ UTR區(qū)。由于待插入的HHR和TPP適配體片段位于EGFP基因下游，缺少合適的限制性內(nèi)切酶位點，且序列較短，僅約120～140 bp。傳統(tǒng)的PCR酶切連接方式的回收效率較低， 影響后續(xù)重組載體的構(gòu)建，故本實驗中利用Overlap extension PCR cloning[32]將核酶開關(guān)片段插入質(zhì)粒中的方法更為高效準(zhǔn)確。設(shè)計兩條5′ 末端磷酸化的上下游引物，引物的一部分為帶插入的序列，另一部分分別和質(zhì)粒插入位置的下游和上游互補，以模板質(zhì)粒擴增全長。

3.2不同TPP濃度下HEK293細胞內(nèi)EGFP基因表達分析

首先通過熒光@微鏡觀察瞬時轉(zhuǎn)染48 h后HEK293細胞內(nèi)EGFP報告基因表達，結(jié)果表明：相比陰性對照pEGFPN1轉(zhuǎn)染細胞的EGFP高表達，陽性對照pEGFPHHR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞熒光明顯降低，表現(xiàn)出良好的核酶剪切功能，但無TPP濃度依耐性 （圖3A）。而隨著TPP濃度升高TPPHHRon1，2轉(zhuǎn)染細胞的綠色熒光的強度有著明顯的增強趨勢； 反之，而在構(gòu)建的3個off型開關(guān)轉(zhuǎn)染細胞中，只有TPPHHRoff1隨著的TPP濃度的升高，EGFP表達明顯下降（圖3B）。

但TPPHHRoff2，3均未見熒光強度的降低，其強度接近于陰性對照， 且無TPP濃度依賴性。這可能是因為接頭序列的不完全配對造成了mRNA二級構(gòu)象的不匹配[23]，而這種改變在哺乳細胞中會受到更多因素的影響，核酶更難以發(fā)揮正確的剪切功能[31]。

為進一步考察不同TPP濃度對EGFP表達的影響，利用流式細胞儀對上述EGFP表達量有改變的轉(zhuǎn)染細胞株平均熒光強度進行定量分析（圖4）。相比陰性對照，pEGFPHHR轉(zhuǎn)染細胞株熒光強度降低近80%，表明此構(gòu)建體系中HHR核酶在哺乳細胞中保持其強勁的剪切作用。在構(gòu)建的兩個激活型開關(guān)中，TPPHHRon1在TPP濃度達50 μmol/L 時熒光表達明顯升高； 150 μmol/L 時，平均熒光強度可增大約3.1倍，接近于報道中作用于原核細胞的Turn on功能[21]，另一TPPHHRon2熒光強度雖有升高，但開關(guān)調(diào)節(jié)功能較微弱，150 μmol/L的TPP調(diào)節(jié)只增加1.8倍的表達。而在構(gòu)建的TPPHHRoff1中，TPP濃度為100 μmol/L 時，平均熒光強度降低了2.3倍，之后隨配體濃度繼續(xù)增加（150 μmol/L），其對EGFP表達的進一步抑制未有明顯效果。發(fā)現(xiàn)3種對TPP有響應(yīng)的核酶開關(guān)，其對TPP敏感濃度約為50～100 μmol/L，實驗中曾將TPP濃度加大到500 μmol/L，但其在各種轉(zhuǎn)染細胞株中并未見明顯作用效果。相對于以往報道中茶堿在哺乳細胞中調(diào)節(jié)濃度均為1～10 mmol/L， 所構(gòu)建的TPP核酶開關(guān)對TPP底物作用的敏感性大大提高。但此結(jié)果也證實了雖然核酶開關(guān)在原核生物或低等真核生物細胞中有良好的調(diào)控作用，但其結(jié)果并不完全適用于哺乳細胞。在很多報道中， 原核生物系統(tǒng)中的核酶開關(guān)可達到1.2～10倍的調(diào)節(jié)功能[23，30]，雖遠小于體外100～10000倍的調(diào)節(jié)幅度[22]，但在真核哺乳細胞中的調(diào)節(jié)效果更低，且調(diào)控能力亦會因轉(zhuǎn)基因或宿主細胞種類的不同而有所改變[31]。相比于原核生物相對簡單的轉(zhuǎn)錄翻譯機制，其核酶開關(guān)在真核細胞中mRNA二級結(jié)構(gòu)的正確形成常會受到更多轉(zhuǎn)錄翻譯等相關(guān)因子的影響，更增加了其調(diào)節(jié)的難度和不確定性。

為了檢測TPP核酶開關(guān)的特異性，在平行樣本中均加入了茶堿。實驗表明，茶堿的添加并不能激活核酶開關(guān)發(fā)生構(gòu)象變化，從而影響報告基因綠色熒光蛋白的表達。結(jié)果表明，這些原本適用于原核生物的核酶開關(guān)對適配體較高的特異性在哺乳細胞內(nèi)仍能得到較好的保留。

4Y 論

研究了原核生物篩選的基于TPP適配體的兩種類型的核酶開關(guān)，通過TPP配體與人工核酶的變構(gòu)作用，激活或抑制核酶的剪切，實現(xiàn)了在哺乳細胞中調(diào)節(jié)報告基因綠色熒光蛋白（EGFP）的表達。此方法可用于間接檢測哺乳細胞內(nèi)微環(huán)境中的TPP濃度，這種基于變構(gòu)活性來調(diào)節(jié)下游報告基因活性的策略，利于通過熒光檢測用于哺乳活細胞內(nèi)代謝物或因子的無標(biāo)記、無損傷、可視、高效的檢測。雖然相對于體外檢測，這種細胞內(nèi)原位檢測方法所需的本底濃度水平較高（umol/L），但今后隨著合成生物學(xué)中基因表達的級聯(lián)放大技術(shù)的發(fā)展和邏輯門等方法的結(jié)合運用， 這種基于核酶開關(guān)的生物傳感器將在提高哺乳細胞檢測敏感性和運用廣泛性方面具有極大的潛力[33]。