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關鍵詞：羊草；分子生物學；遺傳多樣性；組織培養；基因克隆
中圖分類號：S543.901 文獻標識碼：A 文章編號：1007-7847(2007)04-0289-06
羊草(Leymus chinensis)是多年生禾本科賴草屬草本植物，由于其環境適應性較強。具有耐寒、耐旱、耐鹽堿等優點而成為松嫩平原的優勢物種，同時羊草也是一種重要的牧草資源，蛋白質含量高，適口性好，耐踐踏，在發展草原畜牧業方面具有重大的經濟和社會效益，但羊草種子發芽率低、種子萌發最適pH值為8.0～8.5，加上過變放牧和草地鹽堿化日益加重等原因，我國現存系統管理重點實驗室項目(K09M6)羊草草地約有90％以上發生了不同程度的退化，因此，研究羊草的遺傳分化、抗逆機理、栽培育種以及轉基因等對于改善生態環境和草場建設具有重要意義，隨著分子生物學對各個學科的交叉滲透，使羊草的研究從細胞水平進一步深入到分子水平，羊草屬于異交植物，物種趨向于在種群中具有較高水平的變異性，僅在松嫩草原中西部靠近內蒙古高原東部草原上的羊草種群就數以千計，這為研究羊草種群的遺傳多樣性提供了對象，培養愈傷組織是進行羊草轉基因研究的前期工作，但誘導率低的問題尚未得到解決，筆者結合自己的科研工作，對羊草分子生物學領域的研究成果加以綜述，旨為羊草抗逆分子機理研究提供參考資料。
1 羊草遺傳多樣性研究
由于羊草生態適應性強、分布范圍廣、生境類型多樣，在長期的適應和進化過程中，羊草種群之間在形態、生理、生態以及遺傳特征方面均產生了趨異，RAPD(randomly amplified polymorphic DNA，隨機擴增多態DNA)技術可以在對被檢對象無任何分子生物學資料的情況下對其基因組進行分析，而且具有費用較低、方便易行、模板DNA用量少、不需要同位素，在安全性和實驗操作上具有比AFLP(amplified fragment length polymorphism，擴增酶切片段多態性)、SSR(simple sequence rc-peat，微衛星重復序列)等分子標記更加簡便易行等優點，從而使其成為目前研究羊草遺傳多樣性的最重要的手段之一，該技術主要是利用各種群羊草的總基因組DNA作為模版，篩選能夠擴增出具有明顯差異性條帶的隨機引物，以至少兩次重復均出現的結果做0，1矩陣圖，即有條帶記為1，無條帶記為0，計算總片段數及多態位點百分率、各種群間遺傳相似系數和遺傳距離，利用分析軟件進行聚類分析從而得到其遺傳結構樹狀圖，
羊草RAPD分析可以用于研究羊草的種群關系以及遺傳分化的影響因子，崔繼哲等應用RAPD技術證明相似生境或同一地域的種群在一些位點上表現出相似或相同的變化，劉惠芬等運用RAPD技術對內蒙古典型草原不同生境8個羊草種群進行分析，聚類結果顯示生境相似的種群能夠聚在一起，而地理距離最近的種群不一定歸為一類，說明小范圍內羊草種群間的遺傳分化與地理距離不存在相關性，而與其生境間的相似度相關，影響遺傳相似性的不是單一因子而是各種因子的綜合作用，較小地理范圍內羊草種群間的遺傳分化主要是由環境的異質性所引起的，筆者曾以采自中國大安堿地生態試驗站(N45°36′，E123°53′)的羊草種子單株播種栽培，以每株羊草幼苗的地上部為材料進行RAPD分析，30個實驗樣品的平均遺傳距離為0.1909，共可分為4個類群(待發表)，通過RAPD分析，還可以進一步將羊草遺傳分化多樣性的原因具體化，汪恩華等””利用分子標記與形態標記以21個有效隨機引物中對9份羊草材料進行RAPD分析，對隨機抽取的17份禾草種質進行了種質評估的比較研究，結果表明，羊草種質的小穗數、種子千粒重、葉色、有性繁殖量和結實率5個形態學指標與遺傳多樣性指標存在一定的相關性，應用RAPD技術對不同生境羊草在水分脅迫下游離脯氨酸含量的變化做聚類圖比較分析，證實水分是影響羊草種群間遺傳變異和生態型分化的一個最主要的因子，雖然水因子是影響羊草分化的一個主導因子，但是在實際研究工作中也認識到羊草變異和分化是多種生態因子綜合起作用的結果(如溫度、海拔、經緯度、土壤類型等)，而且各因子之間又是相互影響，在不同的生境中限制因子又是變換的，這就造成不同地理種群的羊草遺傳分化過程的復雜性，由此可見，目前以羊草為實驗材料的RAPD分析雖有許多報道。但是由于羊草本身具有較高的種群變異性。組成羊草群落的植物總計有357種，加之尚缺乏一種統一的標準分型方法，因此RAPD技術就成為研究羊草分類及來源的主要工具，在物種鑒定及遺傳分化研究中發揮著重要作用。
除了RAPD技術以外，等位酶技術也可用于羊草遺傳多樣性分析，等位酶是指由一個位點的不同等位基因編碼的同種酶的不同類型，其功能相同但氨基酸序列不同，崔繼哲等通過該技術，綜合分析了松嫩平原11個羊草種群的遺傳多樣性及遺傳分化指標，深入剖析了灰綠型和黃綠型兩種葉色類型羊草種群之間的遺傳差異，證明種群間的遺傳距離與地理距離之間沒有相關，崔繼哲等還采用淀粉凝膠電泳技術，應用等位酶分析方法測定了松嫩平原南部微生境下羊草灰綠色和黃綠色兩種生態型9個種群的遺傳多樣性和遺傳分化程度，證明羊草種、種群和生態型水平都維持較高的遺傳多樣性，兩種生態型之間有明顯的遺傳多樣性差異及遺傳分化，另外，對不同生境、不同分類種群的遺傳結構分析發現羊草種群遺傳變異度很高，但是無論如何歸屬，松嫩草原上的羊草種群遺傳分化程度很低，推測可能與羊草為異花授粉、不同類型混生及種群間基因流強度大有關，劉杰等曾用SSR作為探針構建了羊草的遺傳指紋圖譜，為羊草種質資源評價、種間及種內親源關系分析、生物多樣性研究提供了有效手段，利用AFLP方法對我國不同地區分布的羊草材料進行的DNA多態性分析結果也表明了羊草基因組DNA具有比較豐富的多態性。
2 羊草愈傷組織培養及利用
植物組織細胞培養(plant tissue and cell cul-ture)是通過運用植物組織細胞培養技術實現植物育種獲得新品種的一條快捷途徑，既可以通過
花粉培養、未授粉子房以及胚株培養等誘導形成單倍體植物，也可以通過植物愈傷組織培養中普遍存在的染色體變異實現植物突變育種，另外，通過植物組織培養技術進行的植物細胞融合(尤其是原生質體融合)、胚胎培養以及植物體外受精技術可獲得遠緣雜交種，通過植物組織培養中的莖尖培養能夠產生無病毒原種，因而可用于植物脫毒，解決生產實踐中植物病毒危害問題，組織培養是植物細胞工程學、遺傳學、植物生理學、生物化學與分子生物學研究的重要基礎，不僅用于快速繁殖。還用于單倍體育種、種質保存、生理學研究和基因轉化等領域。
早在上世紀80年代，高天舜就利用羊草根莖作為外植體進行愈傷組織的誘導和植株再生材料，目的是為了改良羊草的遺傳性狀，試圖通過組織培養途徑獲得羊草新類型，該研究采用當年生羊草根莖幼嫩部分的節間基部切段以及隔年生老根莖和當年生根莖的芍間中部、頂部切段作為外植體，消毒處理后接種于3種MS培養基中，先進行暗培養。待長出愈傷組織后轉入光照培養，誘導率平均在20％左右，分化率最高也只有24.2％，羊草幼穗和成熟種子也可作為誘導愈傷組織的外植體，劉公社等，以幼穗作為外植體，恒溫25℃條件下誘導愈傷組織，在加有1mg/L2，4-D MS培養基上繼代2次后，轉移到含1.0mg/L KT和0.5mg/NAA的MS培養基上分化培養得到再生芽，并在無激素的基本培養基上獲得了生根的試管苗，移栽到溫室后可正常生長，盡管從羊草葉片、幼穗和成熟胚在同樣培養條件下均能誘導出愈傷組織，但只有幼穗愈傷組織能夠繼續分化出再生植株，但分化率因基因型和外源激素的不同而不同，以成熟羊草種子為外植體誘導愈傷組織具有操作簡便、污染程度低、材料選擇直觀化的優點，且誘導率和幼苗分化率較高、幼苗健壯、生長勢好，崔秋華等采用3種培養基(MS、B5和8114)，3種2，4-D的濃度水平(1、2、4 mg/L)培養羊草幼嫩根莖和種子，結果表明，以種子作為外植體可獲得較高的愈傷組織誘導率(29.05％)，但目前對于最適激素濃度沒有統一結論，其范圍從1～4mg/L不等，對愈傷組織的誘導效果也未達到令人滿意的水平，仍需要深入研究。
在對羊草愈傷組織的應用方面，可以以羊草種子誘導出的愈傷組織為材料，用含有NaCl的培養基和含有NaHCO3與Na2CO3的混合鹽培養基進行培養，測定羊草愈傷組織的耐鹽性，結果表明羊草愈傷組織對NaCl最大耐受強度為180mmol/L；對NaHC03與Na2CO3的混合鹽的最大耐受強度為4mmol/L中性鹽(NaCl)與堿性鹽(NaHCO3與Na2CO3)對羊草愈傷組織的脅迫機制明顯不同，國內外對于愈傷組織的培養大多應用于轉基因，但在羊草方面進行的該項研究卻很少，劉公社將攜帶PAT基因的質粒通過基因槍法轉化羊草愈傷組織。然后在篩選培養基上進行培養，篩選抗性愈傷組織并轉接到分化培養基上，得到再生苗，然后接種到含有篩選劑的生根培養基上培養后得到轉基因羊草小苗，該研究已獲得耐除草劑的羊草新品種專利，曲同寶等用基因槍將BADH基因轉入由羊草成熟胚誘導出的胚性愈傷組織中，獲得了轉基因植株，經過PCR檢測證明外源基因已整合到羊草基因組中并得以表達，雖然轉入羊草的基因都可被檢測到已整合人羊草基因組中，而且也得到表達，但是對于轉基因羊草對周圍生態環境的影響還未見相關報道，篩選突變體是羊草愈傷組織的另一用途，陳暉等用組織培養方法篩選獲得羊草抗羥脯氨酸(HYP)變異系HR20-8，該變異系細胞內游離氨基酸和蛋白質組分氨基酸含量均發生了較大的變化，與供體對照比較，分別提高2.35倍和1.40倍，其中，游離脯氨酸和蛋白質組分脯氨酸分別提高6.6倍和3.0倍，且脯氨酸合成途徑必需的r-谷氨酸激酶的活性提高了2.5倍。
3 羊草酶蛋白類研究
蛋白質是生物體生命中的第一重要物質，是生理功能的執行者，是生命現象的直接體現者，同時能夠調控相關基因的表達，植物對抗非生物脅迫必然有蛋白質的參與，比如耐冷蛋白、熱休克蛋白、水通道蛋白、赤霉素信號傳導蛋白等，從羊草中檢測這些蛋白的含量以及克隆表達該蛋白的基因對于研究羊草耐逆分子機理和改善羊草品質都具有重要意義。
目前對于羊草酶蛋白的研究還遠遠不夠，主要有細胞色素氧化酶、過氧化物酶、脂酶同工酶等，其應用也僅局限于闡明羊草的遺傳分化，通過聚類分析可以研究羊草種群在不同地理及生態環境中羊草在分子水平上細胞色素氧化酶同工酶存在著種內分化，羊草在同工酶水平上的分化受多個環境因子的綜合影響，而且與羊草耐寒性能存在一定的內在聯系，張麗萍等對采自同一天然草地上葉片呈黃綠色、灰綠色兩種類型羊草的根、莖、葉的過氧化物同工酶、脂酶同工酶進行了分析比較，結果表明，兩種葉色羊草，其相同組織的過氧化物同工酶譜及脂酶同工酶譜基本一致，兩種羊草葉片呈現不同顏色只屬不同生態型，
磁場處理不僅可以促進羊草的生長。而且還能提高羊草的抗鹽堿性，磁場使羊草過氧化物酶(POD)活性提高，并且誘發了一條新的同工酶帶，張衛東等認為羊草自交不孕的原因是自交不親和。并利用禾本科植物自交不親和性有關的硫氧還蛋白(thsioredoxin)^基因設計的引物在羊草DNA中檢測到預期片段，說明硫氧還蛋白h基因可能與羊草的自交不親和性有關，該基因現已被克隆并能夠從GenBank中查到其序列。
研究羊草草原土壤酶的活性可以判斷土壤的肥力，土壤肥力水平接近則土壤酶的活性相似，土壤蛋白酶、脲酶、多酚氧化酶的活性與土壤有機碳、全氮呈顯著相關關系，可以反映土壤肥力水平高低，是評價土壤退化的重要指標。
4 羊草耐逆基因的分離與克隆
羊草具有耐寒、耐旱、耐鹽堿的特性，并且蛋白質含量較高，說明羊草在面對非生物脅迫時高效表達能夠適應、緩解或對抗相應逆境條件的物質，尤其是調控這些物質表達的酶類基因，據報道，羊草種子個體萌發期最大忍受pH范圍是9.14-9.53，對于NaCl可耐受的最大強度為600mmol/L，對于Na2C03可耐受的最大強度為175mmol/L，為了弄清這種適應機制的復雜性，通過大規模的cDNA克隆或者表達序列標簽(EST)的測序分離相關基因是非常重要的，Jin等采集自然生長的植物葉組織經過Na2CO3脅迫處理構建了cDNA文庫，并對其EST進行測序對比分析，推斷在羊草葉和根中各有39和31個非生物脅迫相關基因，這些EST資源將有助于對植物耐鹽堿分子基礎的深入研究和理解。
甜菜堿是在生物體內起著滲透保護作用最主要的細胞相溶性物質，編碼決定該物質合成的關鍵酶一甜菜堿醛脫氫酶(BADH)基因已經先后從多種生物體內得到克隆，并在多種植物中進行了遺傳轉化。已獲得了抗鹽、抗寒、耐旱能力得到較大程度提高的轉基因植株，某些植物體內的甜菜堿含量和BADH活性隨著土壤鹽堿化程度的加重而增加，因此推測甜菜堿可能與羊草耐鹽堿性有關，目前羊草中的部分BADH基因片段也已經被成功克隆。
5 問題與展望
【關鍵詞】齲病；牙菌斑；口腔細菌；代謝產堿
【中圖分類號】R780.2
【文獻標志碼】A
牙菌斑生物膜是定植于牙表面的微生物群落，其與宿主防御之間存在著動態平衡，且與定植部位相適應。牙菌斑生物膜的細菌組成和代謝與齲病和牙周病關系密切。牙菌斑生物膜中糖源物質的攝入，致變異鏈球菌和乳桿菌等菌群產酸和耐酸菌并過度生長形成優勢菌群，牙菌斑內pH迅速下降至臨界值，從而引起牙齒脫礦。過去普遍認為，細菌產酸是齲病發生的直接原因。有學者認為，牙菌斑生物膜中耐酸菌比例的增加和口腔非耐酸性益生菌比例的減少是導致齲病的重要原因。當下的研究卻發現，大部分的口腔益生菌都具有精氨酸脫亞氨酶系統（arginine deiminase system，ADS）或者尿素酶系統，可利用精氨酸或尿素為底物產堿，細菌代謝產堿可積極地調控牙齒脫礦與再礦化之間的平衡，阻止產酸和耐酸菌形成優勢菌群，從而防止致齲性牙菌斑生物膜的形成。
研究顯示，齲病與口腔微生物的產堿能力降低密切相關，調控牙菌斑生物膜中細菌代謝產堿的能力可作為一種有潛在應用前景的防齲策略。隨著細菌代謝產堿的能力與齲病呈負相關性的結論不斷地得以證實，越來越多的研究者開始關注牙菌斑生物膜中細菌代謝產堿的細菌學和分子生物學等基礎和臨床研究。本綜述著重介紹口腔細菌代謝產堿的分子生物學研究進展，為未來的研究方向提供線索。
1 生物膜中細菌代謝產堿的主要途徑
牙菌斑生物膜中細菌代謝產堿最主要的兩大途徑包括尿素酶和ADS。尿素在健康人群口腔中的濃度為3～10mmol·L-1，主要來源于唾液和齦溝液。尿素在口腔中可以被細菌尿素酶迅速分解并產生氨、二氧化碳和水。具有尿素酶活性的細菌包括唾液鏈球菌和內氏放線菌以及口腔嗜血菌屬等。相對于尿素，精氨酸在口腔中的平均濃度僅為50μmol·L-1。精氨酸可以被細菌ADS分解代謝為鳥氨酸、氨、二氧化碳和腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）。與尿素分解代謝不同的是，精氨酸代謝還為細菌提供了ATP，因此賦予了細菌額外的生長能量優勢。多種口腔微生物均具有ADS，包括血鏈球菌、格氏鏈球菌和副血鏈球菌以及某些種類的乳桿菌屬細菌和螺旋體。
精胺代謝是口腔中的另一條堿代謝途徑。與尿素和精氨酸代謝相比較，精胺代謝酶活性較弱。精胺是精氨酸在細菌精氨酸脫羧酶作用下產生的中間代謝產物，也可來源于一些食物。精胺在牙菌斑生物膜和唾液中的濃度分別為0.75和0.2mol·L-1。精胺在細菌鯡精氨酸脫亞氨酶系統（agmatine deiminase system，AgDS）的作用下產生腐胺、氨、二氧化碳和ATP。該系統與ADS具有高度同源性。基因組分析和功能研究表明，AgDS存在于包括變異鏈球菌、表兄鏈球菌、汗毛鏈球菌、大鼠鏈球菌、鏈球菌、緩癥鏈球菌和倉鼠鏈球菌以及唾液乳桿菌和短乳桿菌在內的眾多口腔細菌中，其中大量的細菌與齲病密切相關。目前在所有具有AgDS的細菌中，僅大鼠鏈球菌、血鏈球菌和唾液鏈球菌等益生菌同時具有ADS和尿素酶系統。
2 生物膜中細菌代謝產堿與齲病的關系
有報道稱，慢性腎功能衰竭患者唾液中的尿素水平較健康人高50倍，即使高糖飲食，其患齲率明顯低于健康人群。Nascimento等發現：無齲人群的牙菌斑整體堿活性明顯高于齲活躍人群；成年人非齲易患者唾液中的尿素酶活性是齲易患者的3～5倍，牙菌斑中的精氨酸脫亞氨酶活性是齲易患者的2倍。有報道稱，兒童非齲易患者的牙菌斑尿素酶活性是齲易患者的2倍，唾液尿素酶活性是齲易患者的3倍，而且牙菌斑精氨酸活性是齲易患者的2倍。還有報道稱，在牙膏或漱口液中加入精氨酸類化合物可降低人群的齲失補牙指數。上述研究均表明，牙菌斑生物膜中的細菌代謝產堿水平與齲病的發生呈負相關性。
3 生物膜中細菌代謝產堿的分子生物學研究
3.1尿素酶
口腔細菌代謝產堿途徑的分子生物學研究最早開始于尿素酶，以前的綜述中已經有詳細的介紹。尿素酶是一種含鎳的低聚物酶，編碼尿素酶的7個基因排列成操縱子結構，ureC、A、B基因翻譯產生α、β和γ三個亞基組成（αβγ）3結構，ureDEFG編碼的輔助蛋白用于鎳離子的整合和酶的激活。在有關口腔細菌尿素酶的研究中，唾液鏈球菌和內氏放線菌尿素酶的生物學特性及其基因表達調控的研究最為深入。這兩種細菌的尿素酶有許多相似之處，均受多種環境因素的影響。以內氏放線菌為例，其尿素酶的活性在酸性環境下和有大量糖類物底物時增強，同時其酶活性也依賴于環境中氮源底物的量。值得注意的是，這些因素均與齲病密切相關；因此，Burne等提出當宿主處于患齲高風險時，唾液鏈球菌和內氏放線菌的尿素酶能夠為防止齲病的發生發揮積極的作用。
3.2精氨酸脫亞氨酶系統
原核生物中廣泛存在著ADS，該系統酶具有保守的一級結構。編碼ADS的多個基因通常排列組成操縱子結構，但是其基因的排列順序在不同的細菌間存在著差異。arcA基因負責編碼精氨酸脫亞氨酶，這種酶可水解精氨酸生成瓜氨酸和氨。arcB基因編碼一種分解代謝性鳥氨酸氨甲酰基轉移酶，可將瓜氨酸轉化為鳥氨酸和氨甲酰磷酸。位于arcB基因下游的arcC基因編碼一種分解代謝性的氨甲酸酯激酶，后者可將氨甲酰磷酸的一個磷酸基團轉移給腺苷二磷酸，從而生成ATP、二氧化碳和氨。此外，許多具有ADS的細菌，其操縱子中還存在一種編碼精氨酸和鳥氨酸反向轉運蛋白的arcD基因；精氨酸氨肽酶和相關轉錄調控子也是由ads基因簇中的基因編碼。在具有ADS的細菌中，格氏鏈球菌是唯一由精氨酸脫亞氨酶arc操縱子與queA基因相連并共轉錄的細菌，這種基因被預測編碼一種修飾tRNA的S－腺苷甲硫氨酸：tRNA核糖轉移酶異構酶，后者與ADS轉錄調控子arcR共轉錄。
目前，已有眾多關于口腔鏈球菌和非口腔細菌ads基因調控機制的研究報道。在口腔細菌中，ads基因的組成和調控研究主要集中在格氏鏈球菌、血鏈球菌和大鼠鏈球菌。雖然，ADS在不同細菌中的表達均受到多種環境因素的調控，如pH值、糖源、氧分壓和精氨酸等，但是細菌間調控模式和機制卻不完全相同。以格氏鏈球菌為例，其ADS主要受精氨酸和低pH值誘導，但是碳源性分解代謝物阻遏和高氧分壓對精氨酸脫亞氨酶活性可產生抑制。這些環境因素對ADS的調控主要作用在轉錄水平，環境因素的調控作用主要通過多種調控蛋白質和多個雙組分系統的交叉協同作用來實現。精氨酸對ADS arc基因轉錄的誘導作用主要通過ArcR進行調控；酸性環境誘導arc基因轉錄主要通過ArcR以及VicRK、CiaRH和ComDE的共同作用；碳源性分解代謝物對ADS的阻遏作用，則是通過宏觀調控碳代謝蛋白質（carbon catabolite protein A，Ccp-A）實現的；高氧分壓的環境信號則通過Fnr樣蛋白Flp與雙組分系統VicRK的協同作用，實現對精氨酸脫亞氨酶轉錄的抑制。此外，QueA對arc基因轉錄的影響整體表現為抑制作用，可能與影響了ads基因或其調控基因的轉錄效率有關。細菌間相互作用，如格氏鏈球菌在與內氏放線菌細胞共聚集的狀態下，細菌內源性精氨酸的生物合成被激活，也可導致ADS的活性增強。
3.3鯡精氨酸脫亞氨酶系統
AgDS并非如ADS那樣在微生物細胞中廣泛存在。除部分口腔細菌以外，目前只在糞腸球菌、銅綠假單胞菌、蠟狀芽孢桿菌、希氏乳桿菌和幽門螺桿菌等少數幾種細菌中發現了AgDS。與ADS一樣，AgDS的基因也通常以aguBDAC操縱子的形式排列。精胺依靠一種精胺－腐胺反向轉運蛋白D（agmatine-putrescine antiporter D，AguD）進入細胞，并在aguA基因編碼的鯡精氨酸脫亞氨酶作用下水解為N－氨甲酰腐胺和氨，而N－氨甲酰腐胺又經aguB基因編碼的腐胺氨甲酰基轉移酶代謝生成腐胺和氨甲酰磷酸。最終，aguC基因編碼的氨甲酸酯激酶將氨甲酰磷酸的一個磷酸基團轉移給腺苷二磷酸，從而生成ATP、二氧化碳和氨。腐胺可以在反向轉運蛋白作用下交換細胞外的精胺。agu基因的轉錄調控子由位于agu操縱子上游相反方向的aguR基因編碼。
盡管AgDS的活性在口腔鏈球菌中存在著較大的差異，但其總體活性明顯低于細菌ADS和尿素酶系統；盡管在變異鏈球菌和大鼠鏈球菌中檢測到的AgDS與ADS的活性相似，但倉鼠鏈球菌和表兄鏈球菌AgDS卻較其ADS的活性低50倍以上。在所有口腔細菌的AgDS活性當中，關于變異鏈球菌AgDS的研究最為深入細致，變異鏈球菌AgDS對細菌生長及耐受環境壓力有著重要的意義。研究顯示，變異鏈球菌鯡精氨酸脫亞氨酶缺陷株的生長速度明顯慢于野生株。Burne等也曾報道，當變異鏈球菌鯡精氨酸脫亞氨酶活性表達受到抑制時，其耐受酸、氧氣和超氧化物的能力明顯降低。
變異鏈球菌AgDS的活性表達受到細菌生長和多種環境因素的影響，其影響主要作用于細菌鯡精氨酸脫亞氨酶的轉錄水平。變異鏈球菌AgDS的表達同時依賴外源性底物精胺的供給。在僅有10mmol·L-1外源性精胺供給的情況下，變異鏈球菌鯡精氨酸脫亞氨酶的表達可增高5倍。外環境pH值也是影響變異鏈球菌精胺脫亞氨酶表達的重要因素之一。劉婭玲等利用口腔恒化器模型研究發現，在pH5.5的酸性環境下，變異鏈球菌鯡精氨酸脫亞氨酶的表達水平是pH7.0的中性環境下酶活性的3倍；同時，變異鏈球菌鯡精氨酸脫亞氨酶的表達水平與細菌生長環境中的氧分壓密不可分。氧氣對變異鏈球菌鯡精氨酸脫亞氨酶的表達具有明顯的抑制作用，當變異鏈球菌在無氧條件下培養時，其鯡精氨酸脫亞氨酶的表達是有氧培養條件下的3倍。
變異鏈球菌的AgDS活性依賴于細菌的生長周期，變異鏈球菌的AgDS在細菌對數生長早期表達較低；隨著細菌進入對數生長中期，其酶活性表達逐漸增高；當細菌生長到達靜止期時，其酶活性表達最高。此外，熱刺激效應也可促進變異鏈球菌的AgDS活性表達。變異鏈球菌在44℃的條件下生長，其AgDS的活性表達是37℃條件下的2倍。變異鏈球菌AgDS的基因表達亦受到碳源性分解代謝產物的抑制。作為典型的抑制性糖源，葡萄糖對變異鏈球菌的AgDS具有較強的抑制作用；而當半乳糖作為糖源時，變異鏈球菌鯡精氨酸脫亞氨酶的活性是葡萄糖作為糖源培養條件下的5倍。
在變異鏈球菌中，眾多環境因素對AgDS的調節作用是通過多種調控通路的交叉以及多種調控蛋白質的交互作用來完成的。研究顯示，AguR作為agu操縱子的主要調控蛋白質，參與低pH和底物精胺對AgDS的調控作用。劉婭玲等發現：AguR是一種位于變異鏈球菌細胞膜中的跨膜蛋白質，包括4個跨膜結構域，蛋白質C-末端可能位于細胞內；AguR蛋白在激活時會產生變構裂解，最終與agu操縱子結合啟動agu的轉錄。除此之外，AguR調控蛋白與AguD精胺轉運蛋白的相互作用是調控agu轉錄的關鍵。在低pH值和精胺存在的條件下，AguR調控蛋白可與AguD精胺轉運蛋白發生交互作用，從而誘導AgDS的表達。AguR與精胺結合導致AguR的變構激活，從而促進AguR與其靶標agu操縱子結合。酸性環境有利于AguR形成合適的蛋白質構型，使其對靶DNA的信號轉導更加高效。在缺乏外源性精胺的情況下，AguR與AguD的相互作用可能會阻止AguR與其底物或靶標的結合。該項研究結果對闡明AgDS的調節機制具有重要意義。除AguR和AguD以外，其他多種宏觀調控蛋白和雙組分系統也都同時參與了對變異鏈球菌AgDS的調控作用。CcpA和CcpB作為主要的碳源性分解代謝物阻遏調控蛋白，是不同碳源底物調節AgDS轉錄的主要調控蛋白。包括CiaRH、ComDE和VicRK在內的多個雙組分系統都共同參與了低pH條件下AgDS的誘導，而且CiaRH同時也是變異鏈球菌感受外界熱刺激效應下AgDS優化表達的重要調控因子。目前，雖然有研究例證實雙組分系統之間存在交叉調控和串話現象，但外界環境信號是通過怎樣的具體途徑傳導誘導AgDS表達仍需深入研究。
關鍵詞：鉀離子通道；結構；基因
離子通道(ion channe1)是跨膜蛋白，每個蛋白分子能以高達l08個／秒的速度進行離子的被動跨膜運輸，離子在跨膜電化學勢梯度的作用下進行的運輸，不需要加入任何的自由能。一般來講，離子通道具有兩個顯著特征：
一是離子通道是門控的，即離子通道的活性由通道開或關兩種構象所調節，并通過開關應答相應的信號。根據門控機制，離子通道可分為電壓門控、配體門控、壓力激活離子通道。
二是通道對離子的選擇性，離子通道對被轉運離子的大小與電荷都有高度的選擇性。根據通道可通過的不同離子，可將離子通道分為鉀離子(potassium ion，k )通道、鈉離子(natrium ion，na )通道、鈣離子(calcium ion，ca2 )通道等。其中，k 通道是種類最多、家族最為多樣化的離子通道，根據其對電勢依賴性及離子流方向的不同，可把k 通道分為兩類：①內向整流型k 通道(inward rectifier k channel；kin)，② 外向整流型k 通道(outward rectifier khannel；k out)。k 是植物細胞中含量最為豐富的陽離子，也是植物生長發育所必需的唯一的一價陽離子，它在植物生長發育過程中起著重要的作用，具有重要的生理功能。植物中可能存在k 通道，這一點早在20世紀6o年代植物營養學界就有人提出，而一直到80年代才被schroeder等人[23證實，他們利用膜片鉗(patch chmp)技術，首先在蠶豆(v／c／afaba)的保衛細胞中檢測出了k 通道鉀離子通道的結構單個鉀離子通道是同源四聚體，4個亞基(subunit)對稱的圍成一個傳導離子的中央孔道(pore)，恰好讓單個k 通過。對于不同的家族，4"亞基有不同數目的跨膜鏈(membrane。span。ning element)組成。兩個跨膜鏈與它們之間的p回環(pore helix loop)是k 通道結構的標志2tm／p)，不同家族的k 通道都有這樣一個結目前從植物體中發現的k 通道幾乎全是電壓門控型的，如保衛細胞中的k 外向整流通道等，其結構模型如圖2一a所示。離子通透過程中離子的選擇性主要發生在狹窄的選擇性過濾器(selectivity filter)中(圖2一b)，x射線晶體學顯示選擇性過濾器長1．2 nill，孔徑約nill，k鉀離子通道的作用.有關k 通道在植物體內的作用研究并不多。
從目前的結果來看，認為主要是與k 吸收和細胞中的信號傳遞(尤其是保衛細胞)有關。小麥根細胞中過極化激活的選擇性內流k 通道的表觀平衡常數km值為8．8 mmol／l，與通常的低親和吸收系統km值相似[ 。近年來，大量k 通道基因的研究表明，k 通道是植物吸收轉運鉀離子的重要途徑之一。保衛細胞中氣孔的開閉與其液泡中的k 濃度有密切關系。質膜去極化激活的k 外向整流通道引起k 外流，胞質膨壓降低，導致氣孔的關閉。相反，質膜上h．atpase激活的超極化(hyperpolarization)促使內向整流鉀離子通道(k in)的打開，引起k 的內流，最終導致氣孔的張開鉀離子通道相關基因及其功能特征迄今，已從多種植物或同種植物的不同組織器官中分離得到多種k 通道基因(圖3)，根據對其結構功能和dna序列的分析，可以把它們分為5個大組：工，ⅱ，ⅳ組基因屬于內向整流型通道；m組屬于弱內向整流型通道(weakly inwardakt1arabidopsis k transporter 1)是第一個克隆到的植物k 通道基因，采用酵母雙突變體互補法從擬南芥cdna文庫中篩選出來cdna序列分析表明，akt1長2 649 bp，其中的閱讀框為2 517 bp，編碼838個氨基酸殘基組成的多肽，相對分子質量約為95 400 da。akt1編碼的k 通道，對k 有極高的選擇性，其選擇性依次是k >rb >>na >li 。
northern blot分析表明，akt1組織特異性較強，主要在根組織中表達zmk1(zea mays k channel 1)是從玉米胚芽鞘中分離出的k 通道基因，在皮層表達。在卵母細胞中的表達表明，zmk1編碼的k 通道是通過外部酸化激活的。有研究表明，藍光對zmk1通道在玉米胚芽鞘中的分布有一定影響[3 2l。1組kat1組基因編碼內向整流鉀離子通道，其與akt1組基因產物結構上的最大區別是在cooh端沒有錨蛋白相關區(枷n—related do—main，anky)。kat1組基因主要包括kat1，kst1，sirk，kzm1，kpt1等。kat1(arabidopsis inward rectifier k channel1)是與akt1同時從擬南芥cdna文庫中篩選出來的植物k 通道基因。kat1基因的閱讀框含有2 031個核苷酸，編碼的多肽由677個氨基酸殘基組成，相分子質量約為78 000 da。kat1的表達具有組織特異性，kat1在擬南芥植株中的主要表達部位是保衛細胞，在根和莖中也有少量的表達。人們認為kat1通道可能參與了氣孔開放，并向維管組織中轉運k ，而不是直接從土壤中吸收kj。
以kat1為探針，又能從擬南芥cdna文庫中篩選出kat2等功能類似的內向整流型k 通道基因通過基因工程技術，人們已相繼開展了將kati和akti基因導人到擬南芥、煙草和水稻的研究，并獲得了一些轉基因植株。比如，施衛明等利用根癌農桿菌介導法已成功地把kat1和akt1導人擬南芥和野生型煙草中，并獲得了轉基因植株及其純合株系，發現轉基因植株的吸鉀速率和對k 的累積能力都比對照的有明顯的提高，而且，經過分子檢測，也證實711和akt1基因在轉基因植株中得到了整合和表達。因此，運用現代分子生物學手段和基因工程技術篩選高效利用鉀的作物品種或利用現有的鉀離子通道基因改良作物品種，從而提高作物本身的鉀吸收利用能力應該是目前主要的研究方向。可以相信，隨著分子生物學技術、基因工程技術和有關分析測試技術的發展和應用。隨著研究工作的不斷深入，有關鉀離子通道基因的分離、克隆和利用會取得更大的進展。
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[文獻標識碼]A
[文章編號]1006-1959(2009)07-0280-02
腎細胞癌(renalcellcarcinoma,RCC)是泌尿系統常見的惡性腫瘤之一,長期危害著人類健康。近十年來,對腎細胞癌的分子生物學研究取得了長足的進展,使我們對腎細胞癌有了更深刻的認識。本文就腎細胞癌各種病理分型的分子生物學研究進展進行綜述。
1腎細胞癌發生的分子生物機制
腎癌的發生發展是多階段、多步驟的過程,包括癌基因激活和抑癌基因(tumorsuppressorgene,TSG)失活在內的一系列遺傳學改變。抑癌基因的缺失或失活是腫瘤發生發展過程中重要的分子事件之一。腫瘤常在抑癌基因位點出現染色體基因缺失,表現為等位基因雜合性缺失(lossofheterozygosity,LOH),通過檢測分析腫瘤LOH及其規律,可在染色體一定范圍內發現腫瘤的抑癌基因及易感基因。為了能較全面的了解導致腎細胞癌發生發展的關鍵分子事件,不同學者對腎細胞癌全基因組進行了不同的研究,發現腎細胞癌發生高頻率LOH主要見于以下幾個染色體:3p、5q、8p、9p、10q、14q、17和18q染色體。
1.13號染色體:3號染色體短臂的部分缺失是腎癌基因改變中的高發事件。其中定位于3p25-26的VHL抑癌基因被認為是這些基因改變的首要目標。在以前的研究中,VHL在腎透明細胞癌(cc-RCC)中的失活機制主要為等位基因缺失和突變,DNA超甲基化很少見。劉寧等利用PCR限制性片段長度多態性法對3號染色體上的VHL基因的兩個單核苷酸多態性位點進行檢測來分析VHL基因的雜合性缺失失情況,發現,42%(8/19)發生VHL基因LOH,并未發現VHL基因失活與腫瘤的分期、分級存在聯系。
有雜合性缺失研究顯示,有可能在染色體3p上存在另外的RCC相關抑癌基因。定位于染色體3p14.2上包含最常見的FRA3B脆性位點的FHIT基因作為候選抑癌基因日益受到關注。Velickovic等通過選擇性的檢測FHIT區域的LOH發生情況認為這個基因在ccRCC的發展過程中起到很重要的作用。并且發現在cc-RCC中染色體3p的LOH發生率達76%。Farkas等對88例腎細胞癌病例進行LOH研究,選取了3p14.2-p25范圍內16個位點采用PCR技術進行LOH分析,結果顯示VHL基因和FHIT基因區域,透明細胞癌的LOH發生率高達96%,而狀細胞癌和嫌色細胞癌僅為10%和18%,并且LOH的發生率與腫瘤大小、分期、分級無關。從而認為VHL和FHIT的等位基因缺失是腫瘤發生的早期事件。
1.25號染色體:1986年APC基因首次在一位患有息肉病及多種其它先天性畸形患者的5號染色體長臂片段先天性中間缺失中得到證實,確切的基因位點隨后由定位克隆確定。Pecina-SlausN等利用相對外顯子11和15的特殊寡核苷酸引物對36例腎細胞癌病例進行限制性片段長度多態性的檢測,了解與APC基因相關的LOH情況,并同時檢測APC蛋白的表達情況。研究發現36例樣本中有33例為信息性病例,其中有17例出現LOH,并且LOH的發生與年齡以及腫瘤的TNM分期呈正相關。但并不是所有出現LOH的病例都有APC蛋白的表達。從而認為APC基因與腫瘤的進展有著密切關系,可能不是腫瘤發生的早期事件。
1.38號、9號染色體:Presti等學者對72例腎透明細胞癌進行LOH測定,并將LOH作為臨床預后指標的評估,他們選取了3p,8p,9p,14q四個不同的染色體,在每個染色體上選取兩對引物,結果顯示8p、9p的LOH發生率與腫瘤復發率正相關。由此推測8p、9p的LOH可作為判斷局部進展型腎癌預后的一個指標。
近年來許多學者在多種腫瘤,如肺癌、食管癌、黑色素、胃癌、成神經細胞瘤等研究中均發現,9號染色體常出現較高頻率的LOH,所以推測9號染色體上存在不止一個與這些腫瘤的發生相關的抑癌基因。Fukunaqa等利用熒光多重PCR技術比較提取自腫瘤組織和對應的外周血液樣本中的DNA,通過對9號染色體上的13個位點進行分析,發現109例腎細胞癌中27例至少有一個位點出現LOH,其中最高發生率出現在PTCH基因所在的9P22區域。而Sanz-casla等對40例單發腎細胞癌病例同時進行p16基因附近染色體9p21區域的LOH和p16基因啟動子超甲基化的檢測,出現LOH的為9例,超甲基化的為8例但是兩者之間沒有必然聯系由此推測p16基因的失活和其他未知的抑癌基因共同參與腎細胞癌的發病機制。Grady則通過對60例腎細胞癌病例進行9號染色體上的16個微衛星位點的LOH分析,60例樣本中至少一個位點出現LOH的為44例,主要缺失區域出現在位于9p21的DS171、D9S1749和DS270上。有46%的病例在9q32-9q33出現LOH,在這一區域的D9S170位點LOH發生率達22%,研究認為除了在9p21附近的p16候選抑癌基因外,在9p21以及9q32-9q33附近很有可能存在其它的抑癌基因。
1.410號染色體：Velickovic等對10號染色體上與PTEN/MMAC1抑癌基因相關的7個微衛星標記物LOH發生率進行分析，其中腎透明細胞癌的LOH發生率為37.5%，狀細胞癌為29.7%，嫌色細胞癌為87.5%，且LOH發生率與腫瘤的分期、分級和生存率有關，并且認為雙等位基因失活的發生多由非點突變畸變導致。
1.514號染色體：Kaku等對染色體14q24-31區域的7個微衛星位點進行研究，發現42例信息性病例中23例（54.8%)出現LOH，并發現LOH發生最普遍的區域位于D14S67附近的2-Mb范圍，且LOH的發生率與腫瘤分期呈正相關。同樣Alimov等利用2個RFLP位點對45例腎細胞癌患者進行研究，發現45例信息性病例中17例（38%）在染色體14q31-q32.2上出現LOH，并且LOH的發生率與腫瘤的分級和低生存率正相關。而Gallou等的實驗則將14q上的普遍缺失區域定位于D14S281到D14S277之間。另外有學者對130例腎透明細胞癌病例采用D14S588、D14S617、GATA136B01三個位點進行LOH分析，數據顯示LOH發生率與腫瘤大小、組織學分級、生長速度以及致死率呈正相關。
以上關于14q染色體的LOH研究均顯示與腫瘤的分級和低生存率呈正相關關系，表明腫瘤的14qLOH很可能與腫瘤的侵襲發展有關。
1.617號染色體：p53基因位于17p13.1上，具有反式激活功能和廣譜抑癌作用，與多種惡性腫瘤的發生、發展及預后有關。因此研究染色體17p上TP53位點的LOH情況對于揭示P53在腫瘤發生過程中發揮的作用意義重大。在29例腎細胞癌中，W.M.L.報道了關于P53的雜合性缺失為48%(14/29)，并通過序列測定確認單鏈構象多態性而發現了有11例出現突變。Ogawa等利用p53基因附近的5個多態性探針對48例腎癌進行研究，發現染色體17p的等位基因缺失率為17%(6/36)，并且染色體17p的等位基因缺失與腫瘤分期無確切相關性。其他研究者發現在17號染色體上還存在著其它LOH發生區域。Khoo等對BHD基因區域的2個微衛星位點D17S740和D17S2196進行檢測，28例腎細胞癌中10例（36%）出現LOH，其中6例嫌色細胞癌中2例（33%）出現LOH，6例狀細胞癌中出現5例（83%），透明細胞癌12例出現3例（25%）。并推測BHD基因可能在腎臟腫瘤的發生發展中起重要作用。而Simon-kayser等對處于17q11到17q23之間的7個微衛星標記物進行檢測，15例狀腎細胞癌中14例為信息性病例7例出現LOH。發生頻率最高的為與FBXO47候選抑癌基因相關的D17s250位點。
1.718號染色體：Hirata等對126例腎透明細胞癌病例進行研究，通過對染色體18q上的9個微衛星位點實驗，發現24例(19%)發生LOH，LOH最高發生率出現在DCC基因所在的18q21.3區域，并發現LOH的發生率與性別、腫瘤分期、分級、等參數無關。認為DCC和SMAD4可能做為候選抑癌基因與腎透明細胞癌的發生有關。 2腎細胞癌的病理分型與分子生物學機制
1997年國際抗癌聯盟(UICC)和美國癌癥聯合委員會(AJCC)根據已知基因改變以及腫瘤細胞起源，并結合腫瘤細胞形態特點將腎癌分為透明細胞癌(clearcellrenalcellcarcinoma)、狀腎細胞癌(papillaryrenalcellcarcinoma)、嫌色細胞癌(chromophoberenalcellcarcinoma)和集合管癌（carcinomaofthecollectingducts）4種基本形式。約有4％~5％腎癌細胞形態及遺傳學改變不一，細胞成分混雜或有未識別的細胞成分，此類腫瘤歸為未分類腎細胞癌（renalcellcarcinoma，unclassified），有待今后進一步研究。由于在各型腎癌組織中都可見到細胞質中含有嗜酸顆粒或梭形細胞成分，所以在新分類中取消了顆粒細胞癌和肉瘤樣癌。
腎透明細胞癌或稱為傳統的腎細胞癌或非狀腎癌，約占70％~80％，是最常見的病理類型，起源于腎近曲小管。已明確的遺傳學改變是以3p缺失、VHL基因突變、甲基化或缺失為特征，此外尚有不十分明確的改變。綜合國內外文獻報道，常見的染色體缺失區域包括4q、6q、9p、13q、Xq、8p，常見的染色體擴增區域包括5q、9q、17p、17q。Jiang等利用分枝樹模型及時間樹模型對腎癌比較基因組雜交數據進行分析后認為透明細胞癌至少可能分為兩個亞型，一型伴有-6、+17p、+17q，另一型伴有-9p、-13q、-18q。-4q是透明細胞癌發展過程中除-3p外的另一重要早期事件，-8q多出現在轉移灶中，是原發性透明細胞癌的一個晚期事件，9p、13q上可能存在與腎癌進展相關的抑癌基因。
狀腎細胞癌或稱為嗜色腎細胞癌或腎小管狀癌，約占10％一15％，是第二常見的腎惡性腫瘤，可能起源于腎近曲小管。遺傳學上，以Y染色體丟失、7號染色體和17號染色體的三倍體或四倍體異常為特征，此外較典型的分子遺傳學異常尚有C-MET基因活化、+12q、+16q、+20q、-1P、-4q、-6q、-9p、-13q、-xp、-xq、-Y等。Delahunt和Eble在1997年應用免疫組化方法分析91例狀腎細胞癌，根據形態學改變分為2型，1型狀腎細胞癌光學顯微鏡下呈管狀結構，被覆小細胞，含有卵圓形小細胞核，核仁不顯著，胞質少、灰白。2型狀腎細胞癌為狀結構，被覆豐富嗜酸性胞質的大細胞，含有大球形細胞核。分析結果顯示：7號染色體和17號染色體倍體異常多見于狀腎細胞癌1型，而-Xp常提示預后不良。與透明細胞癌相比，狀腎細胞癌的多灶性或雙腎癌更常見。
嫌色細胞腎細胞癌約占5％，起源于腎集合小管暗細胞。遺傳學以多個染色體丟失和單倍體為特征，LOH常發生在1、2、6、10、13、17或21號染色體。
腎集合管癌少見，起源于腎髓質或腎的中央區集合管上皮，遺傳學上的改變無統一形式，以染色體18、21和Y染色體單體丟失以及染色體7、12、17、20的多倍體異常較常見。
[關鍵詞] 早期宮頸癌；復發；分子生物學
[中圖分類號] R737.33 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）10-39-03
宮頸癌是女性最常見的生殖道惡性腫瘤。宮頸癌死亡率每年大約26萬，其中80%發生在發展中國家，HPV16和18是最常見的兩種致宮頸癌的病毒，70%的宮頸癌由這兩種病毒引起[1]。近年來采用陰道脫落細胞圖片檢查的普及，使不少宮頸癌患者能早期發現、早期治療，提高了患者的生存期。但臨床發現宮頸癌年輕化傾向明顯，25～54歲人群發病率不降反升[2]。導致早期宮頸癌復發的因素較多，許多國內外學者對早期宮頸癌的各方面進行了大量的研究分析，得出了很多與早期宮頸癌復發有關的原因。本資料通過對國內外最近五年相關文獻資料的研究學習，總結導致早期宮頸癌復發的分子生物學因素。
1 宮頸上皮細胞間質轉化
大量的研究表明宮頸上皮細胞間質轉化（EMT）與宮頸癌的形成和轉移復發有密切關系。
1.1 上皮細胞間質轉化（EMT）
正常的上皮細胞靠專門的細胞間粘附力緊密連接在一起，而且具有頂-基底極性。間質細胞形似紡錘體，連接松散，流動性強，具有前-后極性。上皮細胞通過復雜的程序轉變成間質細胞的過程稱為上皮細胞間質轉化。上皮細胞轉變為間質細胞后會失去原來的特性，中間會形成一種亞穩定的細胞既有上皮細胞又有間質細胞的特性，這是一種很多腫瘤都有的過程[3]。上皮細胞間質轉化有3種類型，其中第3型存在于腫瘤的侵襲與轉移中[4]。宮頸上皮細胞通過EMT過程，形成上皮樣的癌細胞失去極性，不穩定，但是還具有上皮細胞的其他特性，經惡化和分化形成具有轉移、侵襲能力的癌細胞。癌細胞離開原始位置，侵入基底膜下，侵入血管和淋巴管隨血液轉移到另一個地方形成轉移灶。在這過程中，還有以下因素參與，干細胞機制[5]、抗吞噬作用[6]、免疫逃避、藥物抗性等。
1.2 EMT的分子生物學
上皮細胞間質轉化的標志性分子變化主要有：（1）E-鈣粘蛋白和β-連環蛋白的下調。E-鈣粘蛋白和β-連環蛋白的下調與早期宮頸癌的組織學分化、轉移和復發成正相關[7]。（2）N-鈣粘著糖蛋白、纖維連接蛋白以及波形蛋白的上調表達。波形蛋白的上調表達與早期宮頸癌的轉移、復發成正相關[7]。（3）Rho GTP酶介導的細胞骨架重排。RhoC在正常宮頸組織、CIN 組織和宮頸癌組織中的表達逐漸增高，在有淋巴結轉移的宮頸癌組織中的表達明顯高于無淋巴結轉移組織，同時RhoC的沉默可以明顯降低SiHa細胞的體外粘附能力和侵襲、遷移能力[8]。（4）調控EMT的基因轉錄因子的上調和易位，如Twist1、Twist2、Snail、Slug、Six1等。Twist1、Twist2和E47抑制E-鈣粘蛋白的表達以及調節其它基因功能誘導EMT過程[9]。
1.3 EMT的信號通路
上皮間質轉化的信號通路有轉化生長因子（TGF-β）通路、Wnt通路、Notch通路、NF-κβ通路等。這些通路相互作用，共同調節EMT的過程[10]。
1.3.1 TGF-β信號通路 TGF-β是一組具有廣泛生物活性的多肽，哺乳動物中有三種亞型TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，其中TGF-β1是TGF-β相關的致瘤作用研究的重點，TGF-β1在腫瘤細胞中是上調的[11]。TGF-β通過細胞膜表面具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的TβR Ⅰ和TβR Ⅱ結合形成復合物。TβR Ⅰ有ALK1/TSR-1、ALK1/TSK7L、ALK5/TβRⅠ 3種受體，TβR Ⅱ只有一種受體。TGF-β與TβR Ⅱ結合形成復合物使TβR Ⅰ磷酸化，隨之smads被磷酸化，誘導該復合物進入細胞核；這一信號通路受到干擾發生異常，與腫瘤的發生有重要關系[12]。與TGF-β信號通路影響細胞核內轉錄的因子有smad、Ras、Rho、TAK1、PP2A、β-catenin 以及NF-κβ、ATF2等。Smad7和TGF-β1與宮頸癌的發生發展、臨床分期、侵潤和淋巴結轉移相關[13]。Stephanie等[14]的研究發現TGF-β信號通路在EMT過程中起著重要作用，從而導致癌細胞具有侵襲和轉移能力。Iancu等[15]研究TGF-β通路在HPV誘導的宮頸癌中發現TGF-β通路的破壞與宮頸惡性進展有很大關系；在宮頸上皮樣瘤變到宮頸癌的過程中TGF-β1表達減少；同時TGF-β1受體基因表達也下降。
1.3.2 Wnt信號通路 Wnt信號通路有經典的Wnt信號通路、Wnt/ca+通路、Wnt/PCP通路，其中經典通路最重要，通過β-catenin激活基因轉錄；其機理概括為WntFzdDshβ-catenin降解復合體解聚β-catenin入核TCF/LEF基因轉錄[16]。參與Wnt信號通路的蛋白有Frizzled、Dishevelled、Gsk3β、CK1、APC、β-catenin等。Wnt信號通路受到刺激后，APC基因突變使β-catenin降解復合物合成障礙，以及β-catenin基因突變使β-catenin不能被磷酸化和泛素化降解，從而使β-catenin降解障礙，胞漿內游離的β-catenin聚集，進入核內激活Cyclin D1、C-myc等基因轉錄，導致腫瘤發生。細胞核的Survivin、Cyclin D1受Wnt通路的激活[17]，影響宮頸癌的復發和轉移。Survivin、P21、Cyclin D1蛋白對早期宮頸癌復發的影響中發現，三者在早期宮頸癌中的表達明顯升高，并且三者共表達時與臨床分期、病理分級有關；Survivin、Cyclin D1表達與早期宮頸癌復發有關，二者共同表達與盆腔淋巴結轉移有關[18]。
1.3.3 Notch信號通路 Notch信號通路是腫瘤血管生成和轉移的一個關鍵因素[19]。Notch信號通路由Notch、Notch配體（Jagged）、受體等組成，其中配體有Delta-like1、3、4，Jagged1、2，CSL，受體有Notch1、2、3、4，Notch信號通路在不同的腫瘤以及不同的階段作用不同。Notch信號通路概括為DeltaNotch酶切ICN細胞核CLS/ICN復合體基因轉錄[19]。Notch1中有Notch1-RBP-Jκ路徑、Notch1-PI3K-PKB-Akt路徑、Notch1-IKK-NF-κB路徑共同相互影響宮頸癌的發生發展[20]。Bajaj等[21]研究發現CD66+細胞中Notch信號通路對宮頸癌有重要作用。免疫組織化學分析顯示Notch3在宮頸鱗癌中過度表達，Notch陽性表達的宮頸癌患者比陰性表達的患者的生存率小[22]。
1.3.4 NF-κB信號通路 基本的NF-κB信號通路包括受體、受體近端信號銜接蛋白、IκB 激酶復合物、IκB 蛋白和NF-κB二聚體。受到刺激后IκB 激酶復合物被激活，IκB 蛋白磷酸化和泛素化，IκB 蛋白被降解，NF-κB二聚體釋放修飾后進入細胞核內，進行基因轉錄。NF-κB一般情況下位于細胞胞漿內，由兩個功能亞單位P65和P50組成，與其抑制因子IκB-α和IκKB-β結合在一起。宮頸癌中IκB-α的去磷酸化使IκB-α減少，從而NF-κB的P65進入細胞核內[23]，參與細胞核內基因的表達調控。NF-κB激活對腫瘤的促進作用主要有：（1）①NF-κB激活對宮頸癌的轉移有明顯促進作用[24]；（2）NF-κB的GADD45α和γ表達下調使腫瘤細胞逃避凋亡；（3）NF-κB上調Cyclin D1等，促進腫瘤細胞生長。NF-κB的P65和c-IAP2的過度表達和caspase-3的下調，是宮頸癌發生發展的重要因素[24]。
2 小結
目前國內外對早期宮頸癌治療后復發的因素研究較多，都認為復發是由于多方面、多路徑的因素共同作用的結果。發現復發轉移的關鍵因素，提高患者的生存率，減輕患者的痛苦是有必要的。除EMT、VEGF信號通路、notch信號通路等，是否可以發現更多關鍵的分子生物學層面的相關因素，使早期宮頸癌能更早的發現，得到早期治療，阻斷關鍵的分子生物路徑，減少復發率。
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迄今為止已發現和膽道腫瘤有關的癌基因有Ras（K－ras，N－ras）、c－myc、c－erbB－2、某些細胞因子及其受體、抗癌基因有P53、P16／MTS1、APC、DCC等。
1 癌基因
ras基因是一個常見的癌基因家族，由K－ras，N－ras，和H－ras三個成員構成［1］。細胞中正常ras基因編碼高度相關的分子量為21000的蛋白質（P21）。P21是一種鳥嘌呤核苷酸（GTP）結合蛋白，它由188或189個氨基酸組成，和細胞生長和分化密切相關。正常P21和GTP結合后激活磷脂酶C，產生第二信使三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油（DG），之后GTP被P21降解，第二信使便執行使細胞分化和生長功能。若正常的ras基因發生了突變而變成了癌基因，其所編碼的變異P21蛋白仍能同GTP結合但是失去了降解GTP的功能，從而使磷酸脂酶C持續活化，產生大量IP3和DG，引細胞過度增殖，最終發生癌變［1］。
現在已在人類多種腫瘤中檢測到了ras基因突變［1］。40％的結腸癌，50％的肺腺癌，30％的急性白血病中均可檢測到ras基因的突變。其突變的作者單位：中國醫科大學第二臨床學院肝膽外科（沈陽110003）崔健現在上海醫科大學中山醫院肝癌研究所（200032）主要方式是點突變，12、13、61密碼子是突變熱點。在胰腺癌中K－ras基因的突變率高達90％以上，而且突變的位點大多局限于K－ras基因12位點上［2］。但是對于膽系腫瘤，關于ras基因突變研究文獻極少，而且結果差異很大，甚至還有完全相反的報道［3～5］。
almoguera應用RNA酶錯配切割法和DNA直接測序，分析膽道腫瘤的病理標本時，未見任何ras基因改變［2］。而Tada等應用DNA測序法研究膽囊癌和膽管癌標本發現肝外膽管癌中偶有ras基因突變，在膽囊癌中則不存在ras基因改變［3］。與之相反，Levi等的研究結果表明膽系腫瘤中存在著廣泛ras基因點突變［4］。他們認為以往文獻所報道的膽系惡性腫瘤中K－ras基因低突變率的原因不在于腫瘤細胞中真的不存在K－ras基因改變，而是檢測方法靈敏度不夠所致。DNA直接測序時，大約需要20％的細胞發生突變才能得到陽性結果，而RNA酶寡核苷酸錯配切割法的靈敏度則更低。他們認為，由于膽道腫瘤是多克隆發病，因而發生K－ras基因突變的細胞只是一小部分，用常規的實驗方法難以檢測出來。他們應用改良的兩步PCR－RFLP法（兩輪堿基錯配PCR＋兩輪限制性核酸內切酶酶切）配以DNA直接測序，發現肝外膽管癌中K－ras基因突變率為100％。這種方法靈敏度非常高，可以在512個等位基因中檢測到一個基因的點突變。
watanabe等應用與Levi類似但更為簡便的方法檢測了20例膽道腫瘤的標本［5］。結果發現55％的膽囊癌、100％的肝外膽管癌均存在K－ras基因改變。總的突變率為75％。絕大多數突變發生在第12位密碼子。常見的突變方式是GA，使GGT變成了GAT，所編碼的氨基酸也隨之由甘氨酸變成了天冬氨酸。少部分發生GGTGTT及GGTTTT改變，這些都導致了相應氨基酸改變，因而均是有意義突變。更為重要的是，他們發現一例膽囊腺瘤癌變的標本中，表面正常的腺瘤已經發生了K－ras基因突變，而且突變方式和癌組織完全一樣，從而在基因水平上支持了膽囊腺瘤癌變的理論。
ajiki等的研究亦表明K－ras基因突變是膽道腫瘤中的一種普遍現象［6］。在他們的研究中，膽囊癌、膽管癌、膽囊上皮不典型增生的K－ras基因12位點的點突變率分別為57％、59％、73％。他們的實驗也發現了一個很有意義的現象：9例發生在膽囊癌周圍的不典型增生，都表現出了和膽囊癌相同的突變。因此他們認為在某些致癌因素（如：膽石、長期膽汁酸刺激等）的作用下，膽囊粘膜腸上皮化生膽囊粘膜不典型增生膽囊癌是膽囊癌的發病機制之一。
yukama 等應用免疫組織化學方法研究了慢性膽囊炎、早期膽囊癌和進展期膽囊癌中ras基因和其他癌基因產物的表達。發現早期膽囊癌中ras基因產物P21陽性表達率高達95％。膽囊炎為33％。其他癌基因產物如c－myc、c－erbB2、表皮生長因子（EGF）、轉化生長因子受體（TGF－β）等在膽囊癌都有高表達，平均陽性率在60％左右。而在慢性膽囊炎中它們表達陽性率較低，平均在10％以下［7］。Lee等的研究結果也表明，與膽囊不典型增生和慢性膽囊炎相比，膽囊癌中P21呈現強表達，陽性率為62％，膽管癌中P21陽性率也達到了50％。P21表達和預后沒有明顯的關系［8］。以上學者都認為：膽囊癌發病過程中存在著多種基因共同作用，其中，ras基因突變可能是早期發生的事件之一。這與ras基因突變在結腸癌發病中的作用是類似的［9］。
c－erbB2癌基因所編碼產物是一種表皮生長因子受體（EGFR）類似物。對于它的研究結果不盡相同。Kamel等的研究結果表明膽囊癌中c－erbB2·35·肝膽胰外科雜志1999年第11卷第1期陽性率大約為10％。膽囊粘膜不典型增生中，其陽性率為0。他們認為c－erbB2表達在膽囊癌中是一較晚事件，只有在細胞癌變后才出現［10］。而Yukama等的研究表明c－erbB2在早期膽囊癌中陽性表達率為69％。在進展期膽囊癌中表達率為0。他們認為c－erbB2癌基因突變是膽囊癌發生早期事件之一［7］。出現這一不同結果的原因可能是：1．他們采用的方法、技術和對陽性率的規定不同。2．所選擇的膽囊癌是由完全兩種不同的致癌因素造成的。因此關于c－erbB2在膽囊癌發生中到底起何種作用，仍需進一步研究。
2 抑癌基因
關于抑癌基因，目前研究最多的是P53基因。P53定位于人染色體17P13，全長為16－20Kb，由11個外顯子構成。正常P53基因編碼野生型P53蛋白，是一種分子量為53KD的核內磷蛋白。人的P53蛋白由393個氨基酸組成。P53基因突變后所編碼的蛋白稱為變異型P53。
在人乳腺癌、腦瘤、結直腸癌、食管癌和肺癌中均已發現P53基因突變，總突變率為50％左右［11～13］。其中83％為錯義點突變，6％為無義點突變，10％為插入或缺失突變。P53的突變并非隨機發生，大多數的突變發生于133－299氨基酸。應用PCR技術研究后發現密碼子132－145、171－179、239－248、272－286為突變熱點。
野生型P53蛋白的主要功能是：抗細胞增殖，抑制細胞生長分裂，使細胞停止于G1期而不進入S期。野生型P53可以阻礙DNA復制起始復合物的裝配，抑制DNA復制，并且在轉錄水平進行調節，防止細胞過度生長分裂。此外野生P53蛋白還可以誘導細胞分化。野生型P53基因失活的細胞經久處于未成熟狀態，持續增生。突變型P53則不具備以上的功能。
野生型P53蛋白極不穩定，半衰期很短，而突變型P53則很穩定，可以在核內積聚，這使得可以用免疫組織化學方法檢測到它的存在［14］。突變型P53的檢測可以很好反映P53基因突變情況［15］。這一點不同于Ras基因。Wee等用S－P法研究了膽囊癌和肝外膽管癌中P53蛋白表達，陽性率分別為73％和64％［16］。他們認為在膽道癌發病過程中，P53基因突變是一個普遍發生的事件，是膽道癌發生內在因素之一。Kamel［10］等的研究結果也表明在膽道癌中普遍存在著P53基因突變。更為重要的是，在兩例膽囊上皮不典型增生的標本中，他們也發現了P53蛋白陽性表達。
hanada等研究發現，在病理類型為平坦型的膽囊癌中，P53陽性率高于息肉型膽囊癌。而平坦型癌多為浸潤癌［17］。Roa的研究也表明，在早期膽囊癌中，P53的陽性率為23．5％，在進展期膽囊癌中，P53的陽性率達到48．2％。在高分化膽囊癌中，P53的陽性率為25％，而在低分化的膽囊癌中，P53的陽性率達到50％［18］。以上研究均提示P53高表達是腫瘤分化低、處于進展期、預后不佳的標志。
p16是近年發現的比P53更有力地引起正常細胞癌變的腫瘤抑制基因，又稱為多腫瘤抑制基因（MTS1）。P16基因定位于人染色體9P21，由三個外顯子構成。總長度為8．5Kb。其編碼產物P16蛋白是細胞增殖周期的重要調節者和控制者［19］。它是細胞周期依賴性激酶4（CDK4）抑制因子。因而又稱M TS1／P16／CDK4。細胞進入分裂周期依賴于周期蛋白依賴性激酶（CDKs）的活化，CDK4和D型周期蛋白結合形成復合物能促進細胞從G1S期的轉變，從而促進細胞增生，這可能是惡性腫瘤發生因素之一。P16蛋白能和CDK4結合，抑制細胞轉化。近年來有關P16基因純合性丟失的研究表明，在人類大部分腫瘤中，均有P16純合性丟失，與雜合性丟失一起，總的突變率為50％。堿基突變和缺失另占25％，故在腫瘤組織中P16總突變率為75％，比P53的50％的突變率高得多。
1995年，Yoshida等人世界上首次報告了P16基因在膽道腫瘤中的突變情況［20］。他們分析了25例膽道腫瘤標本和4個膽系腫瘤細胞株后發現原發膽道腫瘤中P16／MTS1的總突變率為64％（其中膽囊癌80％，膽管癌63％），高于P53突變率。他們認為在膽系腫瘤發生中，P16可能比P53起更重要的作用。但是P16在膽系腫瘤中到底作用如何，具體突變方式如何，因目前研究太少，尚不能得出一個明確結論。
aPC基因和DCC基因是通過對大腸癌研究在人5號染色體上克隆的抑癌基因，前者位于5q21，編碼產物分子量超過300，000，調控ras基因表達。后者也位于5q21，在APC附近。關于他們在膽道腫瘤的研究較少。雖然已在2個人類膽管癌細胞株中發現有5號染色體改變［21］，但應用多種基因探針雜交未發現在肝內膽管癌中有5q［21，22］缺失，故認為APC和DCC與膽管癌關系不大［22］。
3 前景和展望
雖然對于膽系腫瘤的分子生物學研究與胃癌、結直腸癌和胰腺癌相比仍不夠深入，眾多的問題還有待于解決，但是目前的研究結果大大豐富了我們對于膽系腫瘤的認識，這對于尋找早期診斷膽系腫瘤的有效手段具有重要的指導價值。
膽道腫瘤發病率近年明顯上升。由于早期診斷困難，故預后極差。尋找一條有效的早期診斷手段是當前研究的重要課題。從胰腺癌的研究中我們可以獲得一些啟發。1990年Shibata對36例胰腺癌標本作細胞學檢查的同時作K－ras基因突變分析，結果25例細胞學檢查惡性標本中18例測到了ras基因點突變［23］。3例細胞學檢查良性標本無一例發生ras基因突變。8例細胞學檢查為不典型增生標本中，有兩例發生突變。1991年，Tada等對B超引導下胰腺穿刺所獲得的細胞進行基因分析，檢測K－ras基因12位點的突變，成功地為2例細胞學檢查無法判定病變良惡性的病例作出了診斷［24］。隨著研究方法的不斷改進，特別是改良的二步PCR－RFLP方法的應用，人們發現膽道腫瘤中也廣泛存在著K－ras基因12位點的突變，總突變率在75％～100％之間，接近于胰腺癌突變水平。由于PCR技術靈敏性和特異性極高，可以從幾個拷貝的DNA分子中檢測到K－ras基因點突變，因而用十二指腸引流或PTCD檢查獲得膽汁中的脫落細胞，或在B超引導下用細針穿刺膽道腫瘤獲得標本，然后用PCR法檢測標本中K－ras基因12位點突變，有可能開創一條早期診斷膽道腫瘤的新途徑，而且對于常規影像學和細胞學檢查有重要補充價值。
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關鍵詞：豬傳染性胃腸炎；病毒分子；生物學檢測方法
中圖分類號 S858.28 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）12- 0110-02
豬傳染性胃腸炎（TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）導致豬出現脫水、水樣腹瀉以及嘔吐等為主要臨床癥狀的高度傳染性疾病，該病在春季、初秋以及冬季具有較高的發病率[1]。豬傳染性胃腸炎最早發生于美國，隨后在世界各地均有發生，我國于20世紀50年代首次發現該病，目前全國大部分地區均發生過豬傳染性胃腸炎。不同日齡和品種的豬均可以感染傳染性胃腸炎，其中以15日齡左右的仔豬發病后死亡率最高，高達100%；5周齡以上的仔豬感染傳染性胃腸炎后死亡率較低，但是會影響仔豬后期的生長，降低仔豬的飼料利用率。目前，該病已被世界動物衛生組織列為B類必檢傳染性疾病。近年來，隨著分子生物學技術的不斷發展，該技術已經廣泛用于各種細菌性和病毒性疾病的檢測[2]。本文綜述了分子生物學技術在傳染性胃腸炎中的應用，以期能為從事傳染性胃腸炎診斷和防控的工作者提供幫助。
1 傳染性胃腸炎病毒基因組結構和基因表達方式
1.1 TGEV基因組結構 傳染性胃腸炎病毒屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，該病毒的基因組不分節段、單股正股RNA，具有高度傳染性。傳染性胃腸炎基因組全序列分為7個區29kb，結構序列為5'-la-lb-S-3a-3b-sM-M-N-7-3'，并且該基因組的3'-末端以共價鍵結合的poly結構，5'末端有帽結構[3]。基因組1約有20kb，主要負責病毒的編碼，其余基因均在近3'端。傳染性胃腸炎病毒全基因組編碼由4種結構蛋白和3種非結構蛋白組成，其中基因7、基因3和基因1為非結構蛋白，N、M、sM、S為傳染性胃腸炎的結構蛋白。
1.2 基因表達方式 傳染性胃腸炎病毒在胞漿脫殼以后，其正鏈RNA就呈現了mRNA的功能，使基因1轉錄表達RNA聚合酶，同時該基因有作為模板合成負鏈RNA，進而親代RNA與負鏈RNA形成雙鏈復制中間體。因此，在感染傳染性胃腸炎病毒的細胞內，可以檢測出不完全RNA、基因組RNA、mRNA以及雙鏈中間體4個特異性RNA，這可以作為豬傳染性胃腸炎病毒分子生物學檢測指標之一[4]。
2 結構蛋白及功能
豬傳染性胃腸炎病毒的結構蛋白主要為S糖蛋白、M蛋白、N蛋白以及sM蛋白等。S蛋白是豬傳染性胃腸炎病毒纖突的主要成分之一，在病毒粒子的表面，該蛋白基因全長4.3kb，蛋白分子量為195～220ku；S蛋白不僅是決定豬傳染性胃腸炎病毒抗原的重要結構，也影響著病毒對細胞的致病性、親嗜性等。M蛋白是構成病毒粒子蛋白的主要有效成分之一，研究表明[5]，M蛋白前體是由膜外區、信號肽、極性區、跨膜區突于病毒粒子內C-端區等功能區域構成，分子質量為29～31ku；M蛋白不僅決定了病毒粒子的出芽位點和裝配位點，也可以影響病毒變異。N蛋白是一種酸性蛋白質，分子量為47KDa，含有382個氨基酸殘基，該蛋白不僅是豬傳染性胃腸炎病毒的結構蛋白，同時對病毒基因組的加工、復制都具有重要作用。sM蛋白分子質量為78ku，含有1種小膜蛋白和82個氨基酸殘基，該功能蛋白在抗豬傳染性胃腸炎病毒感染的體液和細胞免疫中具有重要作用。
3 分子生物學檢測方法
3.1 核酸探針 核酸探針檢測方法的基本原理是利用核苷酸堿基互補，在堿基互補過程中，采用標記物標記與被檢測靶序列互補的單鏈核酸分子，進而檢測到目的核序列。該檢測方法與掃描電鏡、熒光抗體試驗、病毒分離等相比，具有較好的特異性，并且可以實現快速檢測的目的。現代研究表明[6]，不同的病毒探針可以分別擴增出與其對應的病毒模板，對其他病毒模板影響不大，同時核酸探針擴增的最低檢測限為3 000～6 000個拷貝的單個病毒核酸，具有較高的特異性和敏感性。
3.2 普通RT-PCR方法 該檢測方法使用的首要條件是知道被檢測病原的相關目的基因序列，根據相關目的序列后，采用相關軟件設計相應的引物，然后進行體外擴增目的基因，進而達到檢測的目的。王黎等[7]采用RT-PCR方法檢測豬傳染性胃腸炎病毒，并采用相同濃度做重復性檢測，結果顯示RT-PCR擴增的特異性條帶為590bp左右；然后又以豬瘟病毒、豬細小病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬偽狂犬病病毒以及豬輪狀病毒做特異性試驗，結果顯示僅有豬傳染性胃腸炎病毒得到了特異性目的條帶，所以RT-PCR檢測方法對豬傳染性胃腸炎病毒檢測具有較好的重復性和特異性。
3.3 多重RT-PCR方法 多重RT-PCR檢測方法是以普通PCR為基礎發展的一種新型檢測方法，該檢測方法可以在一個PCR反應體系中加入多對引物，并通過采用優化后的PCR反應條件，達到同時檢測多種病原的目的，具有快速、成本低等優點，目前也常用于各種疾病的診斷。霍金耀等[8]建立了多重RT-PCR法檢測傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、嵴病毒和A群輪狀病毒的方法，并對該檢測方法進行了敏感性試驗和特異性試驗，結果顯示，多重RT-PCR法可以檢測出50TCID50的混合病毒，且能擴增出長度為275bp、544bp、750bp的3條特異性片段，具有較高的特異性和敏感性，可以在臨床上推廣使用。
3.4 套式PCR方法 套式PCR方法需要設計內、外2對引物，并通過2次擴增對樣品進行檢測，該方法相對其他PCR檢測方法，具有較高的敏感性，且節約成本。現代研究表明，PCR技術在檢測病毒時，可以省略不同病毒分離的過程，具有較高的敏感性和特異性，而套式PCR方法在病毒粒子較少的情況下依然能夠檢測出，表明套式PCR比常規PCR具有更好的敏感性。沈海娥等[9]采用套式PCR檢測豬呼吸道冠狀病毒和豬傳染性胃腸炎病毒的S基因序列，根據兩組病毒的基因序列分別設計了2對引物，然后分別以豬呼吸道冠狀病毒細胞和豬傳染性胃腸炎病毒細胞為模板進行套式PCR特異性片段擴增，結果顯示，豬呼吸道冠狀病毒擴增的基因片段為214bp，豬傳染性胃腸炎病毒擴增的基因片段為886bp，同時檢測出了這種病毒，具有較高的特異性和敏感性。
3.5 熒光定量RT-PCR方法 熒光定量RT-PCR檢測方法的原理是在PCR反應體系中采用熒光探針標記法或加入了SYBR GreenI熒光染料標記PCR的反應產物，然后使用反應儀器收集反應產物的熒光信號，并根據熒光信號的強弱確定產物的量，進而達到與起始模板準確定量的目的。該檢測方法與常規RT-PCR相比，不需要進行電泳試驗檢測PCR反應產物，反應結果更為直觀、方便，同時又避免了因電泳試驗對環境造成污染。王建中等[10]根據豬傳染性胃腸炎病病毒的S基因序列設計了引物，并通過多組試驗對熒光定量RT-PCR反應條件進行優化，結果顯示，優化后的檢測方法對其他病原的檢測結果均為陰性，檢測結果的敏感性高達43.07拷貝/μL，是常規PCR檢測方法的100倍，具有較高的敏感性和特異性。
3.6 環介導等溫擴增技術 環介導等溫擴增技術是近幾年新興的一種分子生物學檢測方法，因其具有特異性強、敏感性高、檢測速度以及操作簡單等優點，目前已經廣泛應用于病毒病和細菌病檢測。高睿澤等[11]根據豬傳染性胃腸炎病毒的N基因建立了環介導等溫擴增快速檢測方法，并對該檢測方法的敏感性和特異性進行了評價，結果顯示，該方法在63℃下可以使豬傳染性胃腸炎病毒N基因獲得較高的特異性擴增，且與豬流行性腹瀉病毒等物交叉反應，具有加高的特異性；同時該檢測方法可以檢測到131.4fg/μL的DNA，其靈敏度比常規PCR高出3個數量級。
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【關鍵詞】 中藥； 多藥耐藥； 分子生物學
目前，化療是治療惡性腫瘤的主要手段之一，而在化療過程中易產生腫瘤的多藥耐藥，大大降低了其療效。因此，如何解決多藥耐藥就成為了提高化療療效，改善患者生活質量的關鍵問題。多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是一個多基因參與的過程，涉及多種耐藥相關蛋白［1］。不同腫瘤具有不同的耐藥表型，可以是某種耐藥基因表達，也可能是多種耐藥基因同時表達的結果，而由于中藥的多靶點作用，其可通過作用于多個耐藥相關蛋白達到逆轉多藥耐藥的作用。目前，中藥抗多藥耐藥的作用研究已深入到分子水平。本文概述近年來中藥在逆轉多藥耐藥的分子水平的研究進展。
1 腫瘤多藥耐藥經典途徑
P-gp蛋白介導的多藥耐藥是研究最多，機制最為明確的多藥耐藥產生途徑，因此被稱為多藥耐藥的經典途徑。由MDR1基因編碼的P-gp蛋白ATP依賴性的藥物泵，其是通過水解ATP提供的能量，將進入細胞內的藥物泵出細胞，使得細胞內藥物濃度不斷下降，最終使藥物細胞毒作用減弱甚至喪失出現耐藥［2］。中藥下調P-gp蛋白的實驗研究較多，下面就分體外與體內實驗分別闡述。
1.1 體外實驗研究解霞等［3］對川芎嗪(TMP)逆轉多藥耐藥機制的研究顯示MCF-7/ADM 細胞P-gp蛋白表達率為(90.60±0.41)％，而加入非細胞毒性劑量川芎嗪后，耐藥細胞P-gp的表達率則降為(69.10±1.65)％（P
1.2 體內實驗研究李貴海等［6］粉防己堿對獲得性多藥耐藥小鼠S180腫瘤細胞相關蛋白的調控研究顯示單純應用DDP的模型組，其P-gp蛋白的表達為13.13±5.33，而粉防己堿無毒性高低劑量組其表達分別降為7.41±3.35和9.22±2.36，且其抑制率顯著提高，揭示逆轉耐藥的機制可能與其降低P-gp蛋白的表達有關。
另據實驗報道，中藥三氧化二砷、ECCG、甲基蓮心堿、補骨脂素等也可下調P-gp蛋白的表達而達到逆轉多藥耐藥的作用［7～10］。
2 多藥耐藥的非經典途徑
由MDR1基因編碼的P-gp蛋白過度表達介導的藥物外排是產生MDR的經典機制，除此外，MDR還與多藥耐藥相關蛋白(MRP)、肺耐藥相關蛋白（LRP）、谷胱甘肽S轉移酶、拓撲異構酶、細胞凋亡等多種非經典機制密切相關。
2.1 MRP介導的多藥耐藥多藥耐藥蛋白1(MRP1)屬于ATP結合的盒式(ATP-binding cassette，ABC)運輸蛋白家族成員，它可以通過細胞膜轉運多種抗腫瘤藥，從而限制抗腫瘤藥進入細胞［11］。
徐萌等［12］用漢防己甲素逆轉肺癌耐藥實驗研究發現經漢防己甲素處理12，24，36 h后MRP蛋白表達量的表達分別為32.21±4.79，30.56±4.58，25.55±7.58，而對照組則分別為53.42±7.42，52.98±10.35，60.98±9.37，差異有非常顯著性意義(P
另外，王利等［14］葛根素逆轉人胃癌裸鼠原位移植瘤多藥耐藥性的體內實驗研究顯示5-FU聯合葛根素組MRP蛋白陽性表達率為37.5%，顯著低于對照組生理鹽水組（82.5%）及單純5-FU組（74%）（P
2.2 谷胱甘肽介導的多藥耐藥多藥耐藥的產生機制復雜多樣，其中谷胱甘肽S-轉移酶活性的增強是產生多藥耐藥的重要機制。肖希斌等［15］的研究顯示K562/A02細胞GST-π的PCR擴增帶亮度較強，而經甲基蓮心堿(Nef)處理組PCR擴增帶亮度明顯減弱，提示Nef在mRNA水平上抑制GST-π基因的mRNA轉錄，蛋白質印跡檢測結果亦顯示，未經藥物處理的K562/A02組的蛋白雜交帶，明顯強于K562/A02+Nef組，表明Nef能抑制GST-π蛋白的表達。
苗立云等［16］青蒿琥酯逆轉K562/A02細胞耐藥性機理的研究顯示K562/A02細胞內GSH呈現高表達(P
2.3 核轉錄因子介導的多藥耐藥核轉錄因子（NF-κB）在細胞增殖和凋亡中起關鍵調控作用，而目前有研究顯示其在多藥耐藥的產生中也扮演著重要的角色，陳進偉等［17］K562/A02耐藥細胞NF-κB活性測定的研究發現活化后K562/A02細胞NF-κB表達明顯增強(P
2.4 LRP及拓撲異構酶介導的多藥耐藥肺耐藥相關蛋白（LRP）與拓撲異構酶亦是近期研究較多的耐藥介導介質。LRP作用機制是通過降低藥物的核質分布比率和通過囊泡、胞吐作用將藥物排出細胞［19］。拓撲異構酶(TopoⅡ)是調控DNA拓撲狀態的酶類，據研究發現，TopoⅡ質和量的改變會直接影響與DNA的結合，導致藥物誘導產生的裂解復合物形成減少，從而導致耐藥。孫付軍等［20］研究發現苦參堿可以逆轉小鼠S180腫瘤細胞獲得性多藥耐藥，其研究表明經其誘導后LRP、TOPOⅡ小鼠瘤體中可呈穩定高表達，而給予小鼠100mg/kg苦參堿后的瘤體中兩種蛋白的表達率分別降低為（10.76±6.28）%和（8.58±4.1）%，與對照組相比呈現顯著性（P
2.5 降低細胞內CA2+濃度Ca2+是細胞內一個重要的調節細胞生長、分泌和傳導等機制的信使，自從Tsuruo等初次發現MDR表型的腫瘤細胞內游離Ca2+濃度增高以來，許多實驗證明耐藥腫瘤細胞中Ca2+濃度高于非耐藥腫瘤細胞，又有學者證實鈣拮抗劑可逆轉細胞對藥物的耐藥性。蔡宇等［23］補骨脂素對HL60/HT耐藥細胞逆轉及對細胞內Ca2+濃度影響研究發現耐藥株HL60/HT細胞內Ca2+濃度明顯高于敏感株HL60(P
2.6 凋亡相關基因介導的多藥耐藥Bcl-2家族是細胞凋亡的關鍵調控物，其中Bcl-2相對分子量為26 000，蛋白水平與腫瘤細胞的MDR相一致，其過表達的腫瘤細胞凋亡受抑制，同時對阿霉素、長春新堿、順鉑等多種化療藥物耐藥，其機制可能在于其產物可以穩定細胞生存，抑制多種因素，包括化療藥物誘導的細胞凋亡，從而使細胞產生耐藥［25，26］。
艾小紅等［27］甲基蓮心堿逆轉肝癌HepG2/thermotolerance細胞對阿霉素耐受性的作用發現HepG2/thermotolerance細胞較HepG2細胞高表達Bcl-2蛋白，而甲基蓮心堿能夠下調HepG2/thermotolerance細胞的Bcl-2表達。鐘陸行等［28］參芪扶正注射液對K562/ADM多藥耐藥的影響研究顯示K562/ADM 細胞Bcl-2基因呈現高表達，經10 μl/ml參芪處理后其表達為68.39±3.89，而正常對照組則高達(93.82±2.32)，由此可見參芪扶正注射液可以明顯下調Bcl-2表達率。
3 多靶點作用逆轉機制
整體觀念是中醫的基本特點之一。從現代研究的角度看，可以體現在中藥治療腫瘤的多靶點作用。在逆轉多藥耐藥中，中藥的作用機制也并非只局限于某一點，而是一個綜合的作用，這也正是中藥在逆轉多藥耐藥研究中越來越受到人們重視的原因之一。
3.1 體外實驗研究侯華新等［29］用板藍根高級不飽和脂肪酸對耐藥肝癌細胞株BEL-7404/ADM逆轉作用實驗發現P-gp、MRP蛋白在Bel-7404/ADM 細胞中呈現高表達（與Bel-7404相比，P
3.2 體內實驗研究董琳等［32］甲基蓮心堿對胃癌多藥耐藥的逆轉作用研究發現P-gp、MRP在 SGC7901/VCR細胞中呈現高表達（P
4 結論與展望
目前，研究發現多藥耐藥的產生主要存在以下幾個方面的機制：①P-gp蛋白介導的耐藥，另多藥耐藥相關蛋白(MRP)及肺耐藥相關蛋白(LRP)的異常表達也受到重視；②酶系統異常，包括GSH，GST，DNA拓撲異構酶(TOPOⅡ)和PKC活性改變；③bc1-2基因高表達是抑制腫瘤細胞凋亡、導致腫瘤耐藥的重要因素。而綜合國內文獻發現，中藥對多藥耐藥的逆轉作用亦是多渠道、多途徑的，往往也是通過對不同耐藥途徑的綜合調控作用而實現的。
不過，我們通過對近幾年的文獻研究可以發現中藥在逆轉多藥耐藥研究中亦存在一定的問題，其主要體現在以下幾個方面：①研究多偏重于單體，而對復方研究較少，難以體現中醫辨證施治的特點；②對機制的研究多偏重于經典途徑，而對非經典途徑研究相對較少；③中藥對多藥耐藥的逆轉作用往往是多方面的，而有些文獻報道多只對單個耐藥相關蛋白表達進行研究，不免存在以偏概全之嫌；④亟需探索中藥研究的新方法，從而來彌補中藥成分復雜給實驗帶來不穩定性。
總之，通過對近5年的相關文獻分析，我們發現中藥在逆轉多藥耐藥的研究中已深入到分子生物學水平。其逆轉作用往往是通過對不同的耐藥蛋白的綜合作用而實現的。由于中藥成分的不單一性，使其作用往往不局限于某單一靶點，而是體現于多個靶點。其是通過多靶點的綜合作用，從而可以從多角度、多層次來發揮逆轉多藥耐藥的作用，另外中藥體現出了毒副作用小，作用顯著的優點而愈加受到國內外學者的關注。中藥逆轉劑的進一步研究推廣勢必有益于化療療效的提高和晚期癌癥患者的生活質量的改善。
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非酒精性脂肪性肝病 (nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是以無過量飲酒史(酒精攝入量＜20 g/d)以及肝細胞脂肪變性、氣球樣變、彌散性肝小葉輕度炎癥和(或)肝中央靜脈、肝竇周圍膠原沉積等為臨床病理特點的慢性肝臟疾病［1］，它包括單純性脂肪肝 (nonalcoholic fatty liver，NAFL)、脂肪性肝炎(nonalcohlic steatohepatitis，NASH)、脂肪性肝硬化(fatty liver cirrhosis，FLC)三種類型。NAFLD已成為導致轉氨酶異常的首要病因，并且有部分患者進展到終末期肝病，部分患者甚至與肝臟腫瘤有關。目前我地區NAFLD的發病正在逐漸上升［2］，本病的發病原因尚不完全清楚，認為其發生與胰島素抵抗、氧應激反應和脂質過氧化物質的代謝失衡有關［3］。本文就該病近幾年來其分子生物學方面的一些研究進展綜述如下。
1.氧自由基對肝細胞的損害作用
患者由于甘油三脂在肝細胞內蓄積，大量的游離脂肪酸（FFA）在線粒體內氧化，產生了過多的超氧陰離子和活性氧物質 (reactive oxygen species，ROS)，使抗氧化物質耗竭，過量的過氧化氫 (H2O2)和氫氧根離子 (OH)損傷肝臟細胞的線粒體和細胞膜，使肝細胞正常生長停滯，炎癥變性，最終導致肝細胞變性壞死而引起臨床癥狀［4］。氧是生物維持活性的必要元素，但其在代謝過程中形成的中間產物ROS，與生物膜的磷脂、酶和膜受體相關的多價不飽和脂肪酸及核酸等大分子物質發生脂質過氧化反應，結果使細胞膜的流動性和通透性發生障礙，引起細胞功能失調甚至破裂、死亡。機體在正常生理狀態下，具有完善的抗氧化機制，包括超氧化物歧化酶(SOD)等酶類和谷胱甘肽(GSH)等非酶類活性氧清除劑。現代研究認為，活性氧增多和活性氧清除劑減少是NAFLD的重要發病機制［5］。線粒體是脂肪酸進行β氧化和三羧酸循環、ATP合成和ROS形成的主要場所，線粒體在氧化脂肪和其他燃料供給大多數細胞 ATP時，快速形成 ROS，盡管在這一過程中部分電子可與呼吸鏈上的半醌自由基反應形成超氧陰離子(O2)、過氧化氫 (H2O2 )和氫氧根離子 (OH)等氧自由基，其中超氧陰離子是最重要的毒性氧類產物，但細胞內的抗氧化劑可以清除之，避免其所致的氧化應激和脂質過氧化［7］。線粒體是 ROS形成的主要部位，線粒體電子轉運系統可消耗細胞90％的氧。大量的ROS可直接或間接通過改變線粒體膜通透性轉變孔 (MPTP)的開關，導致細胞凋亡和壞死［8］。 ROS可氧化不飽和脂肪酸導致脂質過氧化，所形成的脂質過氧化物 (LPO)可使部分非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者發生 mtRNA缺失、復制錯誤、修復障礙和斷裂，并造成其呼吸鏈復合物活性降低［4］。DNA對氧應激很敏感，線粒體的DNA(mtRNA)的氧化損傷敏感性比核DNA高達10～16倍，這是由于mtRNA缺乏組蛋白保護、線粒體修復程序不完整以及 mtRNA相似呼吸鏈(該鏈是細胞內 ROS的主要來源)的缺乏［6］。研究發現，大部分NAFLD患者的大部分肝臟 mtRNA均有缺損，造成呼吸鏈復合物活性降低，同時，線粒體缺乏過氧化氫酶，該酶是唯一作用于GSH過氧化氫毒性作用的酶，線粒體不僅是氧應激的源頭，而且是 ROS作用的靶，大量的ROS促成線粒體功能障礙［8］。LPO還可與線粒體蛋白反應形成復合物，抑制電子沿著呼吸鏈的傳遞，使氧自由基形成顯著增多，進而加重線粒體損傷［6］。
2.腫瘤壞死因子(TNFα) 與NAFLD
機體的氧應激反應產生過多的TNFα可以誘導肝臟成纖維細胞、平滑肌細胞、血管內皮細胞、粒細胞和巨噬細胞產生集落刺激因子(GMCSF)，從而影響機體的炎癥反應和脂質代謝［9］。TNFα與早期非酒精性脂肪性肝病損傷有密切關系。有報道，NAFLD患者循環中TNFα水平增高，且TNFα與肝臟損傷的生化指數相關［10］。人們應用逆轉錄聚合酶鏈反應在大鼠非酒精性肝病模型的研究中發現，肝內TNFα mRNA增高的水平與肝臟病理損傷的程度相關，同時發現，抗TNFα抗體可以明顯減輕非酒精性脂肪性肝病大鼠的肝臟炎癥和肝細胞壞死病變，但對肝脂肪變性無影響［11］。對離體人肝胚細胞瘤細胞進行細胞毒性實驗發現，TNFα可以使該細胞生存力下降，這種作用與TNFα抗體引起細胞凋亡有關，抗TNFα抗體可以減輕TNFα的細胞毒性作用［12］。以上研究說明，TNFα在NAFLD的發病中起一定作用。
3.白介素(Interleuldn，IL) 與NAFLD
近年來有研究表明，不同的枯否氏細胞的功能狀態可加重或減輕NAFLD的肝損傷，因此認為其在NAFLD的發病中起重要作用，為此，枯否氏細胞的功能狀態在NASH發病機制中的作用也日益受到關注。人們發現NAFLD不但循環中 ILla和 IL6水平顯著增高，而且兩者的濃度與肝臟損傷的嚴重程度呈高度相關趨勢［13］。采用逆轉錄聚合酶鏈反應研究發現，給大鼠過量的脂肪灌胃2周或 4周，其肝臟內 ILla mRNA水平增高。喂飼過量的脂肪16周的大鼠肝內枯否氏細胞產生的 IL6 mRNA水平較對照組增加4倍。因此認為NAFLD中ILla和IL6的增高可能與 ILla、IL6轉錄水平增高有關［14］。IL6可以刺激培養的人皮膚纖維母細胞合成膠原。有人發現，枯否氏細胞 IL6 mRNA表達的增高與NAFLD纖維化形成有關，提示NAFLD中枯否氏細胞起源程序 IL6可能有促進膠原形成的作用［13］。另外，離體的 ILla、IL6細胞毒性實驗發現，單獨或聯合將 ILla或(和)IL6作用于肝炎細胞不會引起細胞毒性反應［14］。目前，關于 ILla、IL6在NAFLD發病中的作用途徑還在研究中。
4.轉化生長因子β(TGFβ)與NAFLD
TGFβ廣泛存在于哺育動物所有組織中，以血小板和骨組織中表達水平最高。在人體內存在 TGFβ1、2、3三種異構體。TGFβ起著調節細胞生長和分化的作用［15］。NAFLD患者，肝內TGFβ主要來源于枯否氏細胞。目前認為，TGFβ在NAFLD的主要作用是通過誘導細胞外基質的形成，抑制細胞外基質降解，導致肝纖維化形成［16］。從脂肪性肝纖維化大鼠肝臟分離得到的枯否氏細胞作用于肝星狀細胞，可以發現肝星狀細胞產生膠原。為了進一步證實TGFβ的作用，將抗TGFβ IgG預先與枯否氏細胞一起培養，然后去除多余的IgG，此時枯否氏細胞刺激肝星狀細胞產生膠原的作用被抑制，表明脂肪性肝損傷中枯否細胞產生TGFβ是促進膠原形成的重要細胞因子［17］。另外，離體培養的肝竇內皮細胞上的受體可與TGFβ快速結合。肝竇內皮細胞上這種高親和力受體的存在可能是TGFβ作用的重要途徑［18］。研究顯示，增殖細胞核抗原(PCNA)單克隆抗體，停滯于G1／S期的肝竇內皮細胞數量與NAFLD的嚴重程度明顯相關。TGFβ通過與肝竇內皮細胞受體結合抑制其增殖，使其分化為平滑肌樣細胞，后者在肝纖維化中起一定的作用。肝竇內皮細胞增殖抑制還可能通過產生另一些中間介質刺激肝星狀細胞分泌細胞外基質。人體內三種形式的TGFβ在NAFLD中均增高，并且隨病變嚴重程度而增加，其mRNA表達水平明顯增高。肝內TGFβ二聚體具有生物活性，還原劑可使二聚體分離，活性完全喪失，酸性微環境對于激活TGFβ有著重要意義。枯否氏細胞可能首先分泌非活性TGFβ，后者在細胞外或靶細胞表面激活，轉化為活性形式的TGFβ而發揮作用［19］。
此外，本病還受遺傳、環境、免疫和藥物等因素影響，總之，NAFLD的發病機制具有多樣性，仍有廣闊的研究空間。我們堅信隨著對本病研究的不斷深入，其發病機制將會得到進一步的闡明，并為其有效的防治提供措施。
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